Priprava celičnih linij HeLa z izbitima genoma APOBEC3A in APOBEC3BBlanc, Maja (Avtor) Lovšin, Marija Nika (Mentor) APOBEC/AIDAPOBEC3AAPOBEC3BHeLa celiceizbitje genaDružina proteinov AID/APOBEC (aktivacijsko inducirana deaminaza/ katalitičnemu polipeptidu podoben encim, ki preureja mRNA apolipoproteina B) je skupina evolucijsko ohranjenih citidniskih deaminaz, encimov, ki katalizirajo deaminacijo citidina v uridin na enoverižnih polinukleotidih in vplivajo na različne fiziološke funkcije. Gena APOBEC3A in APOBEC3B sta del te družine in se v človeškem genomu nahajata na koromosomu 22, kjer sta v tandemu zložena z ostalimi APOBEC3 geni. Proteini družine APOBEC3 so del prve obrambne linije proti mnogim eksogenim in endogenim retrovirusom, retroelementom in DNA virusom. Prav tako pa igrajo vlogo pri rakavih obolenijih, kjer aberacijski DNA mehanizmi lahko privedejo do tumorskih mutacij. Protein A3A močno inhibira retrotranspozone in viruse. Protivirusno delovanje izraža proti AAV, HSV-1, HPV, HBV, HCMV, HIV-1 in HTLV-1. Delovanje A3A se pojavi tudi pri rakavih obolenjih, kjer preko somatske mutacije na prehodno izpostavljenih ssDNA povzroča mutagene spremembe. Protein A3B inhibira retroelemente in izraža protivirusno delovanje proti HBV, HIV, HTLV-1, EBV, KSHV in HSV-1. Vpleten je tudi v proces mutageneze celičnega genoma. Ekspresija A3B korelira s celičnim cikom in DNA popravnimi geni. V sklopu magistrske naloge smo pripravili celično linijo z izbitim genom A3A oz. A3B. V ta namen smo uporabili sistem CRISPR/Cas9, ki služi za tarčno preurejanje genomov. Plazmidna konstrukta, ki kodirata zaporedja RNA vodnice in protein Cas9 (pX458-A3Ag1, A3Ag2, A3Bg2) smo trasficirali v človeške HeLa celice. Z ustrezno redčitvijo celic smo pričeli enocelične linije in jih vzdrževali, tako da so nastale nove linije iz ene celice. Uspešnost eksperimenta smo potrdili s pomočjo Sangerjevega sekvenciranja genomskega lokusa z izbitim genom. Priprava enocelične linije HeLa celic z izbitim A3B genom ni bila uspešna. Uspešno smo pridobili enocelično linijo HeLa celic z izbitim A3A genom. Pripravljena celična linija bo služila kot osnova za raziskovanje virusov in njihovo obnašanje znotraj človeških celic.20232023-09-02 08:45:32Magistrsko delo/naloga149026sl