Eksperimenti za pripravo novega vektorja za kloniranje PCR-produktov z uporabo sistema toksin-antitoksin IPF_1065/1067 cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806SLKrajnik, Bor (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) sistem toksin-antitoksinvektorji s pozitivno selekcijomolekulsko kloniranjeSistemi toksin-antitoksin so genetski elementi, ki so zapisani na prokariotskih plazmidih in kromosomih. Sestavljeni so iz toksina, ki lahko s svojim delovanjem povzroči propad celice, in antitoksina, ki prepreči delovanje toksina. V bakterijski fiziologiji igrajo pomembno vlogo pri obrambi pred fagnimi okužbami, tvorbi biofilmov in dedovanju plazmidov. Z uporabo toksinov iz sistemov TA v vektorjih s pozitivno selekcijo lahko po transformaciji bakterij z ligacijskimi produkti preprečimo rast celic, ki so sprejele vektor brez vključka. Če z vstavljanjem vključka uspešno prekinemo ali zamaknemo odprti bralni okvir toksina, bakterijska celica preživi, v nasprotnem primeru pa se toksin nemoteno izraža, kar vodi v propad celice. V raziskovalni skupini, v sklopu katere je bilo opravljeno to diplomsko delo, za molekulsko kloniranje PCR-produktov uporabljamo komercialni komplet reagentov. Komplet, ki vsebuje klonirni vektor s pozitivno selekcijo za uporabo v E. coli, predstavlja precejšen strošek, saj se cena za posamezno reakcijo giblje okoli 10 evrov. Da bi ta strošek zmanjšali, smo se odločili razviti nov vektor za kloniranje PCR-produktov, ki bi ga lahko proizvajali v laboratoriju. Na genomu cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806SL je kodiranih več sistemov toksin-antitoksin. Med njimi je edini okarakterizirani sistem tipa II iz naddružine RelE/ParE, ki je sestavljen iz toksina IPF_1065 in antitoksina IPF_1067. Za antitoksin je bilo predhodno dokazano močno izražanje v topni obliki v E. coli. Dokazana je bila tudi toksičnost IPF_1065 za E. coli in zmožnost IPF_1067, da nevtralizira delovanje toksina. Za pripravo novega vektorja smo poskusili zapis za toksin IPF_1065 vstaviti v sinteznobiološka vektorja pSB1C3-BBa_K608006 in pSB1C3-BBa_K608007, ki omogočata konstitutivno izražanje toksina. Da bi preprečili delovanje toksina na celice med molekulskim kloniranjem, smo v celice vstavili tudi plazmid pET-28b(+) – ipf_1067, s katerega se je inducibilno izražal antitoksin IPF_1067. Kljub temu na selekcijskem gojišču ni zrasla nobena transformanta, ki bi vsebovala katerega od novih vektorjev z zapisom za toksin. Eksperiment bi bilo smiselno ponoviti z uporabo drugačnih promotorjev za toksin in antitoksin. Lahko bi uporabili tudi toksin iz drugega sistema TA. Kloniranje bi lahko v tem primeru izvedli v bakterijskem sevu, odpornem na delovanje toksina.20232023-09-01 12:10:00Diplomsko delo/naloga148946sl