Poskus inženiringa reporterskega faga za detekcijo bakterije Staphylococcus aureusMalalan, Kaja (Avtor) Vodovnik, Maša (Mentor) Smrekar, Frenk (Komentor) Staphylococcus aureuselektroporacijaprotein GFPreporterski fagurejanje fagnega genomaCRISPR-Cas9Pomanjkanje učinkovite metode za detekcijo bakterije Staphylococcus aureus je velik izziv za javno zdravstvo, saj je le-ta odgovorna za visoke stopnje obolevnosti in smrtnosti po vsem svetu. V magistrskem delu smo želeli predstaviti inovativno strategijo, ki združuje prednosti fagnih delcev in proteina GFP, za hitro in učinkovito detekcijo bakterije S. aureus. Z vključitvijo gena gfp v fagni genom, se lahko gen gfp med okužbo tarčne bakterije izrazi in omogoči zaznavanje produkta z merjenjem fluorescence. Reporterski fag smo želeli konstruirati z uporabo sistema CRISPR-Cas9, ki bi v fagni genom uvedel dvojni zlom in posredoval rekombinacijo med fagnim genomom in donorsko DNK. Za to je potrebna elektroporacija celic S. aureus s plazmidom z zapisom za gen gfp, obdan s homolognimi regijami, in komponentami sistema CRISPR-Cas9. V predstavljenem delu smo preizkusili različne pogoje elektroporacije celic S. aureus, vendar nam s pripravljenimi elektrokompetentnimi celicami ni uspelo pridobiti transformant. Nazadnje smo uporabili komercialne elektrokompetentne celice in uspeli pridobiti dve transformanti, od katerih smo v eni potrdili prisotnost vstavljenega plazmida z metodo PCRKOL. Ob izolaciji plazmidne DNK iz transformiranih celic smo dobili zelo nizke donose, kar je lahko posledica slabe lize celic, majhnega števila kopij plazmida, uporabe celic v neustrezni fazi bakterijske rasti in nestabilnosti ali toksičnosti plazmida. Zaradi časovnih omejitev v okviru magistrske naloge, nadaljnjih korakov načrtovanega poskusa nismo izpeljali.[K. Malalan]20232023-07-26 12:48:58Magistrsko delo/naloga148048sl