Sinteznobiološka orodja v podporo ultrazvočni stimulaciji celicVarda, Nina (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Gaber, Aljaž (Komentor) kalcijeva signalizacijasidrni peptid KRϕod kalcija odvisno stikaloSposobnost ultrazvoka, da neinvazivno prenese mehanske sile do celic, predstavlja atraktivno možnost nadzorovanja celic na daljavo, kar ima izjemen potencial za aplikacije v medicini in biotehnologiji. Velik izziv pri razvoju takšne stimulacije je učinkovita sklopitev mehanskih dražljajev s specifično aktivacijo procesov v celici. Slednja ob ultrazvočni stimulaciji lahko poteka preko vdora kalcijevih ionov v celico. To povzroči aktivacijo fosfataze kalcinevrin, ki defosforilira jedrni dejavnik aktiviranih T-celic (NFAT). Translokacija transkripcijskega dejavnika v jedro aktivira izražanje genov, ki so pod nadzorom transkripcijskega dejavnika NFAT. Sidranje sintetičnega transkripcijskega dejavnika na osnovi regulatorne domene NFAT s sidrnim peptidom KRϕ na membrano pomembno zmanjša aktivacijo transkripcije tarčnih genov v celičnem mirovanju. Analiza je pokazala nepopolno translokacijo transkripcijskega dejavnika v jedro ob aktivaciji, kar pripisujemo močnejši vezavi sidrnega peptida na membrano. V nalogi smo preverili, ali lahko s točkovnimi mutacijami v peptidu KRϕ izboljšamo razmerje aktivacije od NFAT odvisne regulatorne podenote v mirovanju in vzbujenem stanju. Sidranja peptida KRϕ in mutant na membrano smo spremljali z lokalizacijo in aktivacijo od NFAT odvisne regulatorne podenote transkripcijskega dejavnika povezane s peptidom KRϕ. Pripravili smo 16 mutant peptida KRϕ s spremenjenim nabojem in hidrofobnostjo. Peptid z nabojem 9+ in s spremembo F11L je zagotavljal nizko izražanje luciferaze v nestimuliranih celicah in visoko razmerje med izražanjem luciferaze v stimuliranih in nestimuliranih celicah. V drugem delu naloge smo pripravili od kalcija odvisno stikalo za spremljanje delovanja ultrazvočnega stimuliranja celic. To je temeljilo na dveh antiparalelnih obvitih vijačnicah, povezanih z zaporedjem, ki izvira iz motivov EF-dlani, ki ob spremembi koncentracije kalcija spremeni konformacijo. Na koncih vijačnic sta se nahajala segmenta razdeljenega reporterskega proteina. Odzivnost na spremembo koncentracije kalcijevih ionov smo uspeli zaznati z uporabo razdeljene luciferaze ne pa tudi z razdeljenim fluorescirajočim proteinom.20232023-07-04 14:00:00Magistrsko delo/naloga147396sl