Onesposobitev TLR10 v celicah A549 z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9Leskovar, Neža (Avtor) Ogorevc, Jernej (Mentor) tehnologija CRISPR/Cas9onesposobitev tarčnega genareceptor TLR10določitev funkcije TLR10V genomu bakterij in arhej so prisotne gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (CRISPR), ki s proteini Cas tvorijo kompleks. Ta kot del imunskega odziva ščiti organizem pred virusi in plazmidi. Usmerjevalna RNA, ki deluje kot matrica za vezavo na tarčno zaporedje, omogoči endonukleazno delovanje Cas9 na tarčnem mestu, kjer ta povzroči dvojni prelom tarčne DNA ter posledično uničenje invazivnega tujka. V znanosti se CRISPR/Cas9 uporablja za urejanje genomskih zaporedij na točno določenem mestu. Tehnika je zelo uporabna, saj po povzročenem dvojnem prelomu DNA pride do aktivacije endogenih popravljalnih mehanizmov celice, ki pogosto privedejo do naključnih delecij ali insercij in posledično onesposobitve tarčnega gena. Tehnologija CRISPR/Cas9 je učinkovit pristop urejanja genoma za uporabo v raziskovalne namene, kar se je izkazalo tudi pri preučevanju receptorja TLR10. Receptor sodeluje pri imunskem odzivu sesalcev, a njegova funkcija in ligandi še niso natančno opredeljeni. S tehnologijo CRISPR/Cas9 smo uspešno pripravili celično linijo z onesposobljenim TLR10, kar smo potrdili z različnimi metodami in tako postavili osnovo za preučevanje tega receptorja. Pojavlja se vprašanje, ali TLR10 spodbuja ali zavira vnetni odziv imunskega sistema, za kar v literaturi najdemo nasprotujoče si zaključke raziskav. Izvedli smo poskus, pri katerem smo pripravljeno celično linijo z onesposobljenim TLR10 in kontrolne celice z nespremenjenim genomom stimulirali s Pam3Cys ter spremljali izražanje izbranih citokinov s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. Predpostavili smo, da ima receptor protivnetni učinek in bo tako pri celicah, ki ga ne izražajo, prišlo do povečanega izražanja citokinov. V primeru IL8 in IL1β je res prišlo do povečanja izražanja, pri TNFα pa do zmanjšanja. S poskusom smo pokazali uporabnost tehnologije CRISPR/Cas9 za pripravo celičnih linij, ki lahko služijo za funkcionalno anotacijo in pomagajo pri razumevanju delovanja TLR10.20232023-06-22 10:45:00Diplomsko delo/naloga147071sl