Priprava receptor vezavne domene proteina S virusa SARS-CoV-2 v bakterijah Escherichia coliSajovic, Ema (Avtor) Poklar Ulrih, Nataša (Mentor) Bahun, Miha (Komentor) cirkularni dikroizemdelta plusEscherichia coliinkluzijska telescaNaDS-PAGEpostopna dializaprotein bodicereceptor vezavna domenaSARS-CoV-2ureaNovi betakoronavirus SARS-CoV-2 povzroča koronavirusno bolezen 2019, ki je marca 2020 prerasla v svetovno pandemijo. Protein bodice virusa SARS-CoV-2 je strukturni transmembranski glikoprotein, ki je ključen za vstop virusa v gostiteljsko celico. Virus se s C-terminalno domeno proteina bodice, imenovano receptor vezavna domena RBD, veže na receptor gostiteljske celice. Vezava RBD povzroči konformacijsko spremembo proteina bodice, kar omogoči zlitje virusne ovojnice in gostiteljske celične membrane. V magistrski nalogi smo izrazili gene za rekombinantna proteina RBD izvornega seva virusa SARS CoV-2 in seva SARS-CoV-2 delta plus v bakterijah Escherichia coli. Mutacije, značilne za protein RBD seva delta plus (L452R, T478K in K417N), smo uspešno uvedli v zapis za RBD z enostavno metodo asimetrične verižne reakcije s polimerazo, ki temelji na prekrivajočih koncih. Obe različici proteina RBD sta se v E. coli sintetizirali v obliki netopnih inkluzijskih telesc, ki so se raztopila v pufru z visoko koncentracijo uree. Testirali smo več načinov ponovnega zvijanja denaturiranih proteinov RBD iz inkluzijskih telesc, pri čemer se je kot najuspešnejša metoda izkazala postopna dializa. Preverili smo tudi konformacijsko stabilnost RBD divjega tipa virusa in mutiranega virusa delta plus. Prisotnost sekundarne strukture proteinov smo določili s snemanjem cirkularnega dikroizma v daljnem UV območju, dodatno pa smo konformacijo proteinov ovrednotili tudi z merjenjem fluorescence triptofanskih ostankov. Ugotovili smo, da protein RBD izvornega seva med zamrzovanjem oziroma odmrzovanjem ohrani višjo stabilnost kot različica RBD iz seva delta plus.20232023-06-17 07:16:08Magistrsko delo/naloga146957sl