Priprava in karakterizacija por aktinoporinom-podobnih proteinovRejc, Sebastjan (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) Biotehnologijaporotvorni proteiniaktinoporiniporabiosenzorjihistoniAktinoporini in aktinoporinom podobni proteini predstavljajo veliko skupino α-porotvornih proteinov. Ob vezavi na membrane pride do konformacijske spremembe monomerne oblike, sledi oligomerizacija, kjer pride do povezovanja večjega števila monomerov in tvorbe pore. Velik napredek je narejen na področju uporabe por kot biosenzorjev, kjer so zahteve po robustnih porah, z možnostjo nadaljnjih modifikacij za spreminjanje njihovih lastnosti. V okviru magistrske naloge smo v celicah E.coli BL21 (DE3), izrazili 10 konstruktov aktinoporinskega homologa osnovanega na EST zaporedju iz Orbicella faveolata (Fav). Proteine smo izolirali in očistili z nikelj-afinitetno kromatografijo in njihovo porotvornost potrdili z izvedbo testa hemolize. Sposobnost oligomerizacije in vstavljanja v lipidne membrane smo potrdili tudi na sistemu Orbit mini, kjer smo v membrano DOPC:SM uspešno vstavili vse konstrukte in tako uspešno izvedli biofizikalno karakterizacijo. Za izbor konstrukta, ki izkazuje najmanjši šum električnega toka v primerjavi s kontrolnim konstruktom smo izvedli predhodno tvorbo por in analizo s sistemom Orbit mini na stabilnejših membranah iz lipidov DPhPC. Konstrukt z najmanjšim šumom smo uporabili za poskuse zaznavanja. Za uspešno zaznavanje je bilo potrebno optimizirati električno napetost, njeno polariteto, puferske raztopine in koncentracijo proteina, da smo kljub visoki tendenci do vstavljanja v membrane, pridobili meritve z nizkim tokom, ki odraža prisotnost ene ali dveh por. Ob dodatku histonov H3.1 in H4 so bile vidne specifične blokade, ki omogočajo ločbo med dvema histonskima variantama, ki se v glavnem razlikujeta le v neto naboju in dolžini N-končnega pozitivno nabitega histonskega repka.20232023-06-17 07:15:56Magistrsko delo/naloga146956sl