Interakcija sekretornih fosfolipaz A2 z mitohondrijemIvanušec, Adrijan (Avtor) Križaj, Igor (Mentor) Sekretorne fosfolipaze A2mitohondrijreceptoramoditoksinβ-nevrotoksičnostAlzheimerjeva bolezenSekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2) so ena od družin fosfolipaz A2, encimov, ki katalizirajo hidrolizo estrske vezi v glicerofosfolipidu na mestu sn-2, pri čemer se sprostita prosta maščobna kislina in lizofosfolipid. Vendar pa sPLA2 lahko delujejo tudi kot ligandi za raznolike proteinske receptorje, zato je njihova (pato)fiziologija kompleksna in kljub intenzivnim raziskavam še vedno pogosto nepojasnjena na molekulskem nivoju. Med boljše preučenimi je molekulski mehanizem delovanja ß-nevrotoksičnih sPLA2 iz kačjih strupov (ß-ntx), ki poškodujejo živčne končiče, kar povzroči blokado živčno-mišičnega prenosa in posledično flacidno paralizo. Pri tem je ključna interakcija ß-ntx z mitohondriji. Toksične učinke na živčne celice ima v patoloških okoliščinah tudi sesalska sPLA2 skupine IIA (GIIA), npr. pri nekaterih nevrodegenerativnih boleznih. Ker so sesalske GIIA in viperidne ß-ntx ortologne molekule, bi lahko imeli opaženi učinki enako molekulsko osnovo. Da bi pridobili bolj jasen vpogled v (pato)fiziološko delovanje sesalskih in ß-nevrotoksičnih GIIA na molekulskem nivoju, smo raziskali procese, ki jih amoditoksin (Atx) in njegov podganji ortolog (rGIIA) prožita v mitohondrijih živčnih celic, ter raziskali njun vnos in razmeščanje v teh celicah. Pripravili smo rekombinantna proteina Atx in rGIIA ter njuna encimsko neaktivna mutanta Atx(D49S) in rGIIA(D49S). Pokazali smo, da vsi štirje produkti interagirajo s podenoto II citokrom c oksidaze (CCOX-II). rGIIA in rGIIA(D49S) sta se na ta ključni kompleks dihalne verige vezala s približno 100-krat nižjo afiniteto kot Atx. Kljub temu pa sta obe molekuli rGIIA močno zavirali encimsko aktivnost CCOX v mitohondrijih, izoliranih iz celic PC12. rGIIA se je vezala tudi na mitohondrijski protein z navidezno molekulsko maso 20 kDa, katerega identiteta pa zaenkrat ostaja neznana. Z elektronsko in konfokalno mikroskopijo smo pokazali, da se Atx in rGIIA vnašata v celice PC12 in kolokalizirata z mitohondriji neodvisno od njune fosfolipazne aktivnosti. To nakazuje, da obe sPLA2 za celični vnos uporabljata enako pot. Atx(D49S) in rGIIA(D49S) sta imela tudi podoben učinek v celicah PC12, kjer sta znižala mitohondrijski membranski potencial, ter tkivnih rezinah podganje možganske skorje, kjer sta zavirala encimsko aktivnost CCOX. Rezultati torej kažejo, da ß-nevrotoksične GIIA iz kačjih strupov in sesalske GIIA učinkujejo na nevronske mitohondrije po podobnem molekulskem scenariju, ter nakazujejo verjeten mehanizem, po katerem je GIIA vpletena v Alzheimerjevo bolezen. V prizadevanju za razvoj novih postopkov za diagnostiko, preventivo in zdravljenje Alzheimerjeve ter sorodnih nevrodegenerativnih bolezni bodo naši rezultati dobro izhodišče za testiranje GIIA kot novega zgodnjega označevalca ter potencialne terapevtske tarče pri teh boleznih.20232023-06-16 07:15:02Doktorsko delo/naloga146911sl