Analiza tarč ORF1p, zaznanih z biotinsko identifikacijo, in optimizacija testa retrotranspozicije z vtRNA ter YRNAPolanec, Klementina (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) retrotranspozon LINE1ORF1pvtRNAYRNABioID2Retrotranspozoni LINE1 so pri ljudeh edini še danes aktivni avtonomni mobilni genetski elementi. Predstavljajo kar 17 % celotnega genoma, sodelujejo pa tudi pri prenosu neavtonomnih retrotranspozonov. Element LINE1 zapisuje 3 proteine, in sicer ORF1p, ORF2p in ORF0p. ORF1p je RNA-vezavni protein z aktivnostjo šaperona za nukleinske kisline, ORF2p je endonukleaza in reverzna transkriptaza, funkcije ORF0p pa zaenkrat še ne razumemo dobro. Povišano raven retrotranspozicije LINE1 so opazili že pri več boleznih, vedno več raziskav pa povezuje LINE1 tudi z nekaterimi nevrodegenerativnimi boleznimi. Za razvoj terapevtskih učinkovin je ključno celostno razumevanje retrotranspozicije LINE1. Zato odkrivajo vedno več proteinov in RNA, ki interagirajo s komponentami LINE1, predvsem z ORF1p, in vplivajo na retrotranspozicijo. V prvem sklopu magistrskega dela smo s testom retrotranspozicije in meritvami na pretočnem citometru ugotovili, da RNY4 in vtRNA1-1 statistično značilno inhibirata retrotranspozicijo LINE1. Enak vpliv sta obe molekuli RNA imeli tako v celični liniji HeLa kot v celični liniji HEK293T, in sicer sta delež retrotranspozicije LINE1 znižali za približno eno četrtino. V drugem sklopu magistrskega dela smo analizirali rezultate masne spektrometrije po biotinski identifikaciji interakcijskih partnerjev ORF1p. Z imunodetekcijami po prenosih western smo v eluatih ORF1p-BioID2-HA po testih "pull-down" zaznali 5 potencialnih interakcijskih partnerjev ORF1p, in sicer IGF2BP1, TDP-43, ELAVL1, FUS in hnRNPK. Za te proteine smo s tem potrdili, da so interakcijski partnerji ORF1p. IGF2BP1 in ELAVL1 sta bila v celicah locirana na istih mestih kot prehodno izraženi ORF1p, v glavnem na obrobju mehurjastih tvorb ORF1p. Te bi lahko predstavljale začetne stopnje granulofagije ali endosome. Z analizo obogatenih pojmov genske ontologije smo za potencialne interakcijske partnerje ORF1p ugotovili, da se tako kot ORF1p nahajajo v stresnih granulah, citoplazmi, jedru in jedrcih. Večinoma gre za RNA-vezavne proteine, ki so udeleženi v različnih stopnjah metabolizma RNA. Rezultati prispevajo k boljšemu razumevanju delovanja LINE1 in dejavnikov, ki vplivajo na retrotranspozicijo.20232023-05-31 08:54:59Magistrsko delo/naloga146402sl