Nivo izražanja in aktivnosti katepsina X v procesu diferenciacije nevroblastomske celične linijeKladnik, Jana (Avtor) Pišlar, Anja (Mentor) Diferenciacijacelice SH-SY5Yrast nevritovkatepsin Xzaviralec katepsina XKatepsin X je cisteinska peptidaza, ki s proteolitično cepitvijo C-končnega dipeptida glikolitičnega encima γ-enolaze onemogoča njeno nevrotrofično delovanje. S tem se posredno vključuje v mehanizme diferenciacije nevronskih celic. V sklopu magistrske naloge smo z eksperimentalnim delom na celicah SH-SY5Y ugotavljali nivo izražanja in aktivnosti katepsina X v procesu diferenciacije nevroblastomske celične linije ter opredelili vlogo katepsina X v procesu diferenciacije. V prvem delu magistrske naloge smo postavili model diferenciacije celic SH-SY5Y, pri čemer smo s pogoji diferenciacije želeli spodbuditi nastanek posameznega nevronskega fenotipa. Najprej smo pokazali, da stimulacija celic SH-SY5Y z retinojsko kislino (RA) v koncentraciji 10 in 20 µM poveča izraščanje nevritov, ki so značilni za diferencirane celice. Ravno tako je izraščanje nevritov povečano pri stimulaciji celic z RA v kombinaciji s forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA) oz. nevrotrofičnim dejavnikom možganskega izvora (BDNF) z namenom diferenciacije v posamezen nevronski fenotip, in sicer v dopaminergični oz. holinergični fenotip. Pokazali smo, da RA samostojno oz. v kombinaciji z BDNF spodbudi polimerizacijo F-aktina, kar vpliva na reorganizacijo aktinskega citoskeleta, ki je nujna za diferenciacijo, medtem ko dodatek PMA zavira z RA spodbujeno polimerizacijo. Z uporabo specifičnih nevronskih označevalcev smo delno potrdili nastanek posameznega nevronskega fenotipa. V nadaljevanju smo v diferenciranih celicah pokazali, da je aktivnost katepsina X povečana v celicah, tretiranih z RA samostojno kot tudi z RA v kombinaciji s PMA ali BDNF. Ravno tako je v celicah, diferenciranih v smeri dopaminergičnega in holinergičnega fenotipa, povečan proteinski nivo izražanja katepsina X. Skladno z nivojem izražanja je v celicah diferenciranih z RA v kombinaciji s PMA oz. BDNF povečana intenziteta fluorescence katepsina X, določena z uporabo konfokalnega mikroskopa. Opazna je lokalizacija katepsina X v izrastkih, ki nastanejo tekom diferenciacije celic SH-SY5Y, obenem pa je vidna ko-lokalizacija z γ-enolazo v rastnih conah nevritov. V zadnjem sklopu naloge smo vpletenost katepsina X v diferenciacijo potrdili z določanjem vpliva zaviranja delovanja katepsina X na proces diferenciacije. Uporabili smo ireverzibilni zaviralec katepsina X AMS36. Zaradi vidnih sprememb v morfologiji celic in povečanja izraščanja nevritov v prisotnosti zaviralca lahko sklepamo, da z zaviranjem delovanja katepsina X spodbujamo nadaljnjo diferenciacijo, kar nakazuje na pomembnost proteolitičnega uravnavanja γ-enolaze v procesu diferenciacije nevronov.20232023-02-08 07:45:02Magistrsko delo/naloga144263sl