Učinki porotvornega nistatina na lipidne mehurčke celičnih velikostiKristanc, Luka (Avtor) Božič, Bojan (Mentor) Sollner Dolenc, Marija (Komentor) biofizikafosfolipidni mehurčki celičnih velikostiprekomembranske poresteroltvorba napetostne poreosmotski pojaviNistatin spada v skupino makrolidnih polienskih antimikotikov. Podobno kot amfotericin B ima širok spekter antimikotičnega delovanja, vendar se navkljub velikemu potencialu uporablja skoraj izključno topikalno, saj je ob sistemski uporabi nefrotoksičen.Biološka aktivnost nistatina je povezana predvsem z njegovo zmožnostjo tvorbe transmembranskih kanalčkov v plazemskih membranah odzivnih celic, ki prepuščajo različne ione in celo manjše molekule, kar na koncu privede do porušenja elektrokemijskih gradientov ter nazadnje do celične smrti. Klinična uporabnost polienskih antimikotikov temelji na dejstvu, da imajo precej izrazitejši učinek na celice gliv, katerih membrane vsebujejo kot glavni sterol ergosterol, kot pa na človeške celice, za katere je značilen holesterol. Mehanizem delovanja polienov na ravni membrane še ni v celoti pojasnjen, pogledi raziskovalcev pa se razlikujejo zlasti glede pomena in načina vplivanja sterolov. Temeljni cilj raziskav v okviru disertacije je bila torej dopolnitev znanja o mehanizmu delovanja nistatina na ravni celične membrane, kar predstavlja osnovo za njegovo učinkovitejšo uporabo pri zdravljenju okužb ter zmanjševanje toksičnosti za človeške celice. Pridobljeno znanje o porotvornem delovanju nistatina pomeni tudi prispevek k razvoju reguliranega prenosa zdravilnih snovi v celice. Membransko delovanje nistatina smo sprva preučevali na fosfolipidnih mehurčkih celičnih velikosti iz 1-palmitoil-2-oleil-glicero-3-fosfoholina (POPC), pripravljenih po elektroformacijski metodi. V ta namen smo z uporabo mikromanipulacijskega sistema in mikropipet prenašali mehurčke, napolnjene s saharozno raztopino, v izomolarno glukozno raztopino z dodanim nistatinom v koncentracijah od 10 do 900 μmol/L ter jih opazovali pod faznokontrastnim mikroskopom. Uporabljena metodologija, ki predstavlja novost na področju preučevanja polienov, je omogočila spremljanje oblikovnih sprememb membran in osmotskih pojavov na posamičnih mehurčkih. Eksperimenti z brezsterolnimi mehurčki so razkrili tri osnovne vzorce odzivov mehurčkov, ki so prehajali en v drugega ob višanju koncentracij nistatina v merilni raztopini. Pri nižjih koncentracijah nistatina (150–250 umol/L) je prišlo do sprememb oblik mehurčkov ter do nastanka različno oblikovanih izrastkov z značilnimi časovnimi vzorci spreminjanja oblik in dolžin. Slednje je posledica spreminjanja ravnovesne razlike v površinah med zunanjim in notranjim fosfolipidnim monoslojem (dA0), zato smo z natančnim spremljanjem omenjenih časovnih vzorcev lahko pojasnili zaporedje korakov pri vgrajevanju nistatina v membrane. V območju srednje visokih koncentracij nistatina (250–400 umol/L) so se 2 pojavljale kratkotrajne napetostne pore ter s tem povezano bledenje mehurčkov, ki je bilo vse hitrejše z višanjem koncentracij nistatina. Pri najvišjih koncentracijah (> 400 umol/L) pa je prišlo do bolj obsežnih in stabilnejših napetostnih por, to je počasnih in hitrih pokov. Pojav napetostnih por smo uspeli razložiti z osmotskimi procesi in dvigom lateralne napetosti membrane zaradi tvorbe transmembranskih nistatinskih kanalčkov z večjo prepustnostjo za glukozo kot za saharozo. Zviševanje površinske gostote nistatinskih kanalčkov pospeši osmotske procese, kar vodi v čedalje večjo obstojnost napetostnih por ter na koncu povzroči eksplozije. S teoretičnim modelom smo lahko zadovoljivo opisali posamezne tipe osmotskih pojavov ter ocenili, kako se spreminja površinska gostota nistatinskih kanalčkov v membranah v odvisnosti od koncentracij nistatina v merilni raztopini. Dokazali smo torej, da je porotvorno delovanje nistatina možno tudi v brezsterolnih membranah, glede česar doslej ni bilo konsenza. Nato smo v membrane dodajali holesterol in ergosterol v različnih molarnih deležih. Eksperimenti s POPC-holesterolnimi mehurčki so namreč osnova za preučevanje toksičnosti nistatina za človeške celice, tisti s POPCergosterolnimi pa za preučevanje delovanja nistatina na tarčne mikrobne patogene, to je glive in tripanosomatidne kinetoplastide. Izkazalo se je, da ergosterol v membranah izrazito pospeši vgrajevanje nistatina vanje ter njegovo porotvorno delovanje, o čemer priča pomik značilnih morfoloških sekvenc in osmotskih pojavov, katerih osnovno sosledje ostane v osnovi enako, k nižjim koncentracijam. Za POPC-ergosterolne mehurčke so bile značilne tudi dolgotrajne napetostne pore, ki predstavljajo mehanizem, ki je morda pomemben tudi v in vivo pogojih. Po drugi strani je prisotnost holesterola v molarnem deležu, tipičnem za sesalske celice (45 mol%), blago zavrla delovanje nistatina. Pokazali smo tudi, da je učinkovanje nistatina v kompleksnem, nelinearnem odnosu z deležem ergosterola v membranah. Primerjave so pokazale, da ti rezultati lahko pomenijo prvo potrditev teoretično napovedanih sterolnih supermrež v primeru mehurčkov celičnih velikosti. Z uporabo teoretičnega modela smo ugotovili, da zaznanih osmotskih pojavov ni možno razložiti zgolj z vplivi sterolov na mehanske lastnosti lipidnih membran, temveč da moramo upoštevati predvsem njihove neposredne vplive na vgrajevanje in porotvorno aktivnost nistatina. Temeljne toksikološke raziskave delovanja nistatina na holesterol vsebujoče mehurčke smo dopolnili s preučevanjem učinkov nistatina na ovarijske epitelijske celice kitajskih hrčkov (celicah CHO) z uporabo faznokontrastne in fluorescenčne mikroskopije. Tudi pri celicah je prišlo do nabrekanja ter pojava napetostnih por zaradi osmotskih procesov spričo porotvorne aktivnosti nistatina. Po drugi strani pa smo pri celicah opazili tudi odzive, ki se razlikujejo od tistih pri mehurčkih. Pri nizkih koncentracijah nistatina nismo opazili nitastih izrastkov, kar smo pripisali sploščenju izvihkov notranjega monosloja, t. i. kaveol, kar bi lahko uravnotežilo vgrajevanje nistatinskih molekul v zunanji monosloj. Pri višjih koncentracijah nistatina pa so se na celičnih membranah razvili sferični izrastki (blebi), ki so se z višanjem koncentracij postopno večali in združevali, vse do pojava nabreklih celičnih oblik, imenovanih celični mehurčki, ki so pri najvišjih koncentracijah pokali. Omenjene osmotske pojave pri celicah smo primerjali s tistimi pri mehurčkih in jih opisali z dopolnjenim teoretičnim modelom. S študijami celične viabilnosti ter s prikazom razgradnje aktinskega citoskeleta, označenega z zeleno fibrilarno beljakovino, pa smo jih uspeli povezati tudi s procesom celične smrti. [L. Kristanc]20162023-01-12 07:52:00Doktorska disertacija143778sl