Uporaba molekulskega modeliranja pri načrtovanju antagonistov DC-SIGN in in vitro vrednotenje njihovega učinkaJug, Gregor (Avtor) Anderluh, Marko (Mentor) Tomašič, Tihomir (Komentor) DC-SIGNlektini tipa Cantagonistiračunalniško podprto načrtovanjemolekulsko modeliranjesidranjevalidacijapatogenivirus HIVinfekcijedisertacijeInfekcijske bolezni so na letnem nivoju druge po številu povzročenih smrti, takoj za kardiovaskularnimi boleznimi. Med infekcijskimi boleznimi oz. povzročitelji le-teh največje težave povzročajo virus HIV, Mycobacterium tuberculosis in malarija. Znano je, da različni patogeni v telo vstopajo tudi preko proteina, t.i. za dendritične celice specifičnega, medcelično adhezijsko molekulo-3-vezočega ne-integrina oz. DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular Adhesion Molecule-Grabbing Non-integrin). Gre za lektin tipa C, ki se nahaja na površini dendritičnih celic (DC). Zanj je značilno, da poleg virusa HIV veže še precej drugih patogenov. Ob vezavi na DC-SIGN pride do internalizacije patogena v fagocitozni mehurček. Nekateri patogeni, vključno z virusom HIV, v tem destruktivnem okolju »preživijo« ter se tako skupaj z zrelimi DC prenesejo po limfi vse do bezgavk in tako naprej po telesu, kar ima za posledico različne vrste infekcij. V sklopu doktorske disertacije smo se osredotočili na načrtovanje novih spojin, kompetitivnih antagonistov DC-SIGN, ki bi zavirale vezavo glikoproteina gp120, ki ga virus HIV izraža na svoji ovojnici. Omenjene spojine bi s svojim delovanjem preprečile vdor virusa HIV preko DC-SIGN v telo ter s tem (verjetno) ubranile organizem pred okužbo ter posledično obolelostjo za AIDS-om. Izvedli smo strukturno podprto in silico načrtovanje antagonistov DC-SIGN. Ker pred začetkom našega raziskovalnega dela ni bilo identificiranega nobenega primernega orodja za molekulsko sidranje v zelo plitko in odprto vezavno mesto DC-SIGN, smo se v prvem koraku odločili za validacijo nam dostopnih orodij za molekulsko sidranje: AutoDock, CDOCKER (vključen v programsko opremo Accelrys Discovery Studio 3.0), FlexX (vključen v programsko opremo LeadIT), FRED (vključen v programsko opremo OpenEye) in GOLD. Validacijo smo izvedli z uporabo treh različnih kristalnih struktur kompleksov DC-SIGN-ligand (PDB oznake 2IT6, 2XR5 in 2XR6), ki smo jih uporabili za ponovno sidranje (t.i. »re-docking«) spojin, ki so vključene v kristalne strukture omenjenih kompleksov. Rezultati validacije kažejo na to, da je najbolj primerno orodje za molekulsko sidranje na izbrani protein FRED, kateremu sledita CDOCKER in FlexX. Pokazali smo tudi, da AutoDock in GOLD nista primerni orodji za uporabo pri molekulskem sidranju v CRD DC-SIGN. Da bi dokazali uporabnost vzpostavljenega protokola za molekulsko sidranje z orodjem FRED, smo izvedli virtualno rešetanje namensko pripravljene knjižnice spojin. Izhodišče je predstavljalo 32 spojin, ki smo jih načrtovali in in vitro testirali v sklopu naše raziskovalne skupine. Za vsako od 32 spojin smo dodatno generirali 50 strukturno podobnih spojin (t.i. »lažnih spojin« oz. »decoys«). Dobili smo knjižnico s 1632 spojinami, s katero smo preverili uporabnost protokola za molekulsko sidranje, kot je navedeno zgoraj. Rezultati so pokazali, da je bilo vseh 32 spojin, katerim smo že uspešno dokazali vezavo v vezavno mesto DC-SIGN tekom in vitro testiranja, uvrščenih med zgornjih 5,6% rangiranih spojin. Poleg tega sta bili spojini z največjo afiniteto vezave (IC50 = 40 μM oz. 50 μM) rangirani kot četrta oz. peta rangirana spojina. Omenjeno potrjuje, da je vzpostavljen protokol primeren za izvedbo začetne faze, t.j. virtualnega rešetanja in strukturno podprtega načrtovanja ligandov – antagonistov DC-SIGN. Dodatno smo pokazali, da je vzpostavljen protokol za molekulsko sidranje z orodjem FRED, primeren tudi za uporabo pri molekulskem sidranju na druge, DC-SIGN podobne lektine. Za potrditev smo izvedli sidranje liganda v vezavno mesto proteina Langerin (PDB oznaka 3P5F), ki spada v isto skupino lektinov tipa C, ter ima podobno strukturo domene za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD) kot DC-SIGN. Vezavno mesto za ogljikove hidrate se nahaja na ekstracelularni domeni DC-SIGN, točneje v sklopu domene za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD). Najbolj pomemben za vezavo ogljikovih hidratov na DC-SIGN je Ca2+ ion, ki se nahaja v vezavnem mestu in je ključen za tvorbo koordinacijskih vezi med ligandom in CRD. Poleg Ca2+ iona imajo pomembno vlogo za vzpostavitev interakcij ligand-protein tudi aminokislinski ostanki DC-SIGN (npr. vzpostavitev H-vezi). Spojine smo načrtovali na podlagi podatkov iz temeljite študije vezavnega mesta, ki je bila v preteklosti narejena v sklopu naše raziskovalne skupine. Vezavno mesto, ki je sicer zelo plitko in iz tega stališča zelo težavno za strukturno podprto načrtovanje potencialnih ligandov z molekulskim sidranjem, ponuja nekatere neizkoriščene strukturne atribute, ki smo jih tekom načrtovanja želeli izkoristiti za namen vzpostavitve dodatnih interakcij med proteinom in ligandom. Prvo možnost predstavlja hidrofobna votlinica, locirana za Phe313. Druga možnost, ki se je tekom našega dela izkazala kot precej zanimiva, je sam Phe313, ki zaradi lege aromatskega obroča omogoča tvorbo π-π interakcij z ligandi, ki imajo v svoji strukturi aromatske obroče. Tretjo možnost pa predstavlja raven hidrofoben del vezavnega mesta, ki ga velja izkoristiti za izboljšanje jakosti vezave liganda v vezavno mesto. Tekom načrtovanja novih potenicalnih antagonistov DC-SIGN smo izhajali iz osnovne manoze, ki je ključna za prepoznavo in vzpostavitev interakcij med spojino in Ca2+ ionom ter nekaterimi aminokislinskimi ostanki v vezavnem mestu proteina. Manozi smo na podlagi izsledkov iz literature in lastnega znanja ter poznavanja strukture proteina dodajali primerne distančnike in funkcionalne skupine. Usmerili smo se v strukture, ki nudijo primerne geometrijske in elektrokemijske lastnosti za uspešno vezavo osnovne manoze, kakor tudi možnost interakcij z dodatnimi področji proteina, predvsem s Phe313. Pri raziskovalnem delu smo potrebovali protein DC-SIGN, ki ni komercialno dostopen. S tem namenom smo del raziskovalnega dela opravlili na inštitutu IBS (»Institut de Biologie Structurale«) v Grenoblu v Franciji. Pripravljen rekombinantni protein DC-SIGN ECD smo uporabili pri in vitro testiranju antagonistov DC-SIGN ter pri izvedbi vrednotenja vezave z uporabo metode STD NMR. Kot dodaten cilj smo si zadali pripravo rekombinantnega fluorescenčno označenega proteina DC-SIGN ECD, ki bi ga uporabili pri razvoju novega in vitro testa za preverjanje afinitete vezave načrtovanih antagonistov DC-SIGN. Načrtovane spojine, za katere smo predvideli potencialno visoko afiniteto vezave, smo v sklopu raziskovalnega dela Katedre za farmacevtsko kemijo uporabili pri izvedbi in vitro testa. Uporabili smo robusten in vitro test, ki temelji na kompetitivni vezavi spojine in gp120 na DC-SIGN ECD, ki smo ga pred tem vezali na primerno podlago. Samo uspešnost vezave naših načrtovanih spojin smo preverili z reakcijo z biotinom ter z merjenjem kemiluminiscence. V sklopu raziskovalne skupine smo izvedli in vitro testiranje ter tako preverili afiniteto vezave za 32 novih spojin. Pri dveh spojinah smo dobili IC50 vrednosti v mikromolarnem območju (40 μM oz. 50 μM). V zadnjem sklopu raziskovalnega dela smo podrobneje proučili interakcije štirih izbranih monovalentnih ligandov na osnovi manoze z vezavnim mestom DC-SIGN. Najprej smo z molekulskim sidranjem predvideli vezavno pozo vseh diastereoizomerov spojin, pri čemer smo uporabili validirana protokola za molekulsko sidranje v programih FlexX in FRED. Rezultati sidranja kažejo, da je program FRED osnovno manozo pravilno umestil v vezavno mesto, ter da je dodatno pravilno predvidel tudi hidrofobne interakcije in/ali π-π interakcije med ligandom in stransko verigo Phe313. Da bi odpravili pomanjkljivosti, ki so del molekulskega sidranja, smo v nadaljevanju dva kompleksa ligand-protein uporabili pri Gregor Jug Uporaba molekulskega modeliranja pri načrtovanju antagonistov simulaciji molekulske dinamike (MD). Z metodama STD NMR in MD smo ponovno potrdili pomen osrednje manoze pri interakciji s Ca2+ ionom ter tako za vezavo v vezavno mesto proteina DC-SIGN. Prav tako smo določili pomembnost strukturnih elementov v stranskih verigah, ki dodatno prispevajo k vezavi na protein. Podatki kažejo, da so sicer te interakcije precej šibke, kar gre pripisati zelo plitvemu in slabo definiranemu vezavnemu mestu, kar predstavlja precejšnjo oviro pri snovanju novih močnejših antagonistov DC-SIGN. Zanimivost, ki smo jo razbrali iz rezultatov, so interakcije ligandov s hidrofobno ravnino v vezavnem mestu. Le-ta predstavlja dodatno možnost za vzpostavitev interakcij ter tako predstavlja smernico za nadaljnji razvoj antagonistov DC-SIGN. Predvidevamo, da bo na osnovi rezultatov doktorskega dela možno v prihodnje načrtovati antagoniste DC-SIGN z večjo afiniteto, pri čemer se bo kot uporabna metoda lahko uporabljal validiran protokol za molekulsko sidranje z orodjem FRED. Kot dobro izhodišče za nadaljnji razvoj bodo vsekakor služili tudi podatki in vitro testiranj načrtovanih spojin, kakor tudi študija interakcij antagonistov DC-SIGN z vezavnim mestom, ki smo jo izvedli s kombinacijo metod molekulskega modeliranja in STD NMR. Pri slednjem smo določili tudi novo področje vezavnega mesta, ki ga velja pri načrtovanju novih ligandov izkoristiti in tako izboljšati afiniteto vezave.[G. Jug]20162023-01-11 12:45:23Doktorsko delo/naloga143763sl