Časovna odvisnost odziva modelnega nevretenčarskega organizma (kopenski rak enakonožec, Porcellio scaber, Isopoda, Crustacea) na nanodelce TiO [spodaj] 2 v hraniMenard, Anja (Avtor) Drobne, Damjana (Mentor) nanodelciokoljeorganizmionesnaževanjeraziskavedisertacijeV doktorski disertaciji smo preučevali strupene učinke nanodelcev TiO2 na modelni nevretenčarski organizem (kopenski rak enakonožec, Porcellio scaber, Isopoda, Crustacea). Nanodelci TiO2 se proizvajajo v velikem obsegu in imajo široko uporabnost v številnih industrijskih in potrošniških proizvodih, posledica česar je njihovo sproščanje v okolje, kjer lahko zaradi svoje majhnosti in specifičnih lastnosti povzročijo strupene učinke na različne organizme v okolju. Nekatere predhodne študije so pokazale, da imajo nanodelci TiO2 strupene učinke na različne organizme v okolju. Glavni namen doktorske disertacije je bil opisati časovno odvisnost odziva modelnega nevretenčarskega organizma P. scaber na nanodelce TiO2 v hrani. Za preučevanje strupenih učinkov nanodelcev TiO2 na modelni organizem P. scaber smo uporabili ekotoksikološki laboratorijski test določanja strupenosti kemikalij s kopenskim rakom, ki omogoča merjenje odzivov na različnih nivojih biološke organizacije. Poleg fizioloških označevalcev (smrtnost, sprememba mase in stopnja prehranjevanja), ki kažejo odzive na nivoju organizma, smo spremljali tudi citološki (destabilizacija celičnih membran) in histološka označevalca (debelina epitelija prebavnih žlez in količina lipidnih kapelj v B celicah prebavnih žlez). Na celičnem nivoju smo določali destabilizacijo celičnih membran prebavnih žlez modelnega organizma z uporabo prilagojene metode diferencialnega barvanja s flourescentnima barviloma (akridin oranžem in etidijevim bromidom) in flourescentno mikroskopijo. Z opazovanjem histoloških sprememb v prebavnih žlezah kopenskega raka P. scaber pa smo preučevali učinke zaužitih nanodelci TiO2 na debelino epitelija (ocenjene na podlagi oblike in velikost B celic prebavnih žlez) in količino lipidnih kapelj v B celicah prebavnih žlez. Na podlagi skupne obravnave debeline epitelija prebavnih žlez in količine lipidnih kapelj v B celicah prebavnih žlez pa smo ocenili vpliv zaužitih nanodelcev TiO2 na fiziološko stanje živali. V doktorski nalogi smo predvideli, da potencialna strupenost zaužitih nanodelcev TiO2 za modelni organizem P. scaber ni odvisna le od odmerka, ampak tudi od trajanja izpostavitve ter da se s trajanjem izpostavitve učinek stopnjuje, vendar je le ta odvisen od merjenega označevalca. Ugotovili smo, da različne koncentracije nanodelcev TiO2 (1000, 2000 in 5000 μg/g suhe mase lista) pri različnih izpostavitvenih časih (3, 7, 14 in 28 dni) nimajo očitnega vpliva na preživetje in spremembo mase modelnega organizma P. scaber. Tudi sprememba stopnje prehranjevanja je bila neodvisna od časa izpostavljenosti ali koncentracije zaužitih nanodelcev TiO2, opazili pa smo stohastični tip odziva. Prav tako učinek nanodelcev TiO2 na destabilizacijo celičnih membran celic prebavnih žlez ni bil odvisen od koncentracije niti časa izpostavitve. Merjeni fiziološki označevalci strupenosti in citološki označevalec so pokazali, da se s podaljševanjem časa izpostavitve (28 dni) modelnega organizma P. scaber in povišanjem koncentracije nanodelcev TiO2 v hrani (5000 μg/g suhe mase lista) učinek ne stopnjuje. V naši raziskavi s fiziološkimi označevalci (preživetje, sprememba mase in stopnja prehranjevanja) in citološkim označevalcem (destabilizacija celične membrane) nismo opazili bistvenih strupenih učinkov nanodelcev TiO2 na modelni organizem P. scaber po 28 dneh prehranjevanja s hrano, kateri smo dodali različne koncentracije nanodelcev TiO2 (1000, 2000 in 5000 μg/g suhe mase lista). Izpostavitev modelnega organizma nanodelcem TiO2 pa je povzročila histološke spremembe v B celicah prebavnih žlez. Z višanjem koncentracije nanodelcev TiO2 v hrani se je povečal delež živali s tanjšim epitelijem prebavnih žlez in delež živali z zmanjšano količino lipidnih kapelj v B celicah prebavnih žlez. Stanjšanje debeline epitelija in zmanjšanje količine lipidnih kapelj v B celicah prebavnih žlez smo opazili že pri najnižji testirani koncentraciji (1000 μg/g suhe mase lista). Nanodelci TiO2 so povzročili tudi spremembo fiziološkega stanja živali pri koncentraciji 1000 μg/g suhe mase lista. Z višanjem koncentracije nanodelcev TiO2 v hrani se je povečeval delež živali pod stresom. Histološke spremembe v B celicah prebavnih žlez in sprememba fiziološkega stanja živali so posledica odziva modelnega organizma na stresne razmere, ki so nastale zaradi prehranjevanja modelnega organizma z nanodelci TiO2. Ugotovili smo, da je za interpretacijo strupenih učinkov nanodelcev TiO2 potrebno uporabiti več različnih označevalcev, ki omogočajo merjenje odzivov na različnih nivojih biološke organizacije. Rezultati našega raziskovalnega dela so pokazali, da je pri ugotavljanju potencialnih strupenih učinkov nanodelcev TiO2 za kopenskega raka P. scaber ključnega pomena izbira pravega označevalca. Na podlagi skupne obravnave fizioloških označevalcev in histoloških označevalcev smo ugotovili, da nanodelci TiO2 v hrani nimajo strupenih učinkov na modelni organizem, povzročijo pa stanje stresa, ki je povezano s koncentracijo nanodelcev TiO2 v hrani. Z rezultati našega raziskovalnega dela smo pokazali, da je potrebno ekotoksikološki laboratorijski test določanja strupenosti kemikalij s kopenskim rakom nadgraditi z merjenjem ustreznih histoloških označevalcev, ki so tudi mera fiziološkega stanja živali, preden se zaključi, da nanodelci TiO2 nimajo učinka na modelni organizem, v našem primeru P. scaber. V doktorski disertaciji smo na podlagi rezultatov 28 dnevnega laboratorijskega testa strupenosti nanodelcev TiO2 za modelni organizem P. scaber in podatkov v prosto dostopni literaturi pripravili oceno tveganja za kopensko okolje. Za oceno tveganja smo izračunali razmerje med predvideno koncentracijo v okolju (PEC) in ocenjeno varno koncentracijo (PNEC). Pri pripravi ocene tveganja smo uporabili konzervativne predpostavke. Rezultati ocene tveganja za okolje so pokazali, da je razmerje med PEC in PNEC (RCR) < 1, kar nakazuje, da nanodelci TiO2 uporabljeni v naši raziskavi ne predstavljajo potencialnega tveganja za organizme v tleh. Ugotovili smo, da trenutno dostopni podatki niso zadostni, da bi lahko izdelali zanesljivo oceno tveganja. Naša ocena tveganja vsebuje številne predpostavke, ki vodijo v številne negotovosti. Ocena tveganja se lahko spremeni, ko bo na voljo več podatkov o dejanskih izpustih in koncentracijah nanodelcev TiO2 v okolju, podatkov o strupenosti nanodelcev TiO2 za kopenske organizme ter podatkov o usodi in obnašanju nanodelcev v okolju. [A.M. Srpčič]20162023-01-11 12:16:47Doktorska disertacija143760sl