Uporaba naravnih spojin vodnic ter in silico podprto rešetanje kemijskih knjižnic pri načrtovanju in sintezi novih protibakterijskih učinkovin in modulatorjev ionskih kanalčkovJukič, Marko (Avtor) Anderluh, Marko (Mentor) protibakterijske učinkovineionski kanalčkinapetostno odvisni natrijevi kanalčkimodulatorjinačrtovanjesintezanaravne spojine vodnicekemijske knjižnicerešetanjemorske spužveAgelassekundarni metabolitioroidinklatrodinbiološka aktivnostvrednotenjemetoda vpete krpice membranedisertacijeNapetostno odvisni natrijevi kanalčki so veliki transmembranski proteinski kompleksi odgovorni za prevajanje električnih tokov v živčnih, mišičnih in endokrinih celicah in tkivih. Napake v njihovi ekspresiji in funkcijske spremembe so povezane z mnogimi patološkimi stanji. Tako se pri zdravljenju epilepsije, bolezni centralnega živčevja, bolezni srca in bolečinskih stanj uporabljajo učinkovine z modulatornim delovanjem na natrijevih kanalčkih. Le-te delujejo neselektivno na tip natrijevega kanalčka in izkazujejo širok nabor neželenih stranskih učinkov. Spojine, ki bi selektivno delovale na posameznih tipih napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov, bi omogočile razvoj indikacijsko specifičnih učinkovin in olajšale študij vloge posamezenih tipov natrijevih kanalčkov v patofiziologiji. Ker so organizmi morskega izvora razmeroma neraziskan vir spojin vodnic, smo v okviru doktorskega študija uporabili alkaloida oroidin in klatrodin iz morskih spužev rodu Agelas kot izhodišče za načrtovanje in sintezo novih modulatorjev ionskih kanalčkov. Spojini vsebujeta terminalni 2-aminoimidazol povezan preko 3-aminopropenskega distančnika s halogeniranim ali nesubstituiranim pirolom na drugem koncu molekule. Pri načrtovanju spojin smo ohranili v oroidinu in klatrodinu prisotni aminoimidazolni strukturni element, saj predvidevamo da gre za ključni farmakoforni element. S pomočjo načrtovanja na osnovi liganda smo pripravili osredotočeno knjižnico analogov oroidina in klatrodina, kjer smo 3-aminopropenski distančnik zamenjali z delno rigidiziranim centralnim piperazinskim fragmentom. V okviru načrtovanja potencialnih modulatorjev napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov smo preučili tudi vpliv zamenjave terminalnega pirola z različnimi aromatskimi ali heteroaromatskimi obroči na delovanje spojin. Sintetizirane spojine smo biološko ovrednotili na več tipih napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov z metodo vpete krpice membrane. Ugotovili smo, da pripravljene spojine izkazujejo šibko jakost delovanja na tip 1.3 natrijevih kanalčkov, pri čemer je pomembna razdalja med terminalnima heteroaromatskima dušikoma. Potrdili smo domnevo, da je za delovanje ključen aminoimidazolni fragment, katerega bioizosterne zamenjave niso bile tolerirane v kontekstu delovanja na kanalčke. Opazili smo tudi ključno prisotnost karbonilne skupine ob terminalnem pirol-2-karboksilnem strukturnem fragmentu. Le-tega smo zamenjali z večjim heteroaromatskim indol-2-karbonilom in pripravili piperazinski analog klatrodina z IC50 vrednostjo 19 μM in selektivnim delovanjem na 1.3 tipu napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov. Spojina ni izkazovala delovanja na 1.4, 1.5 ter 1.7 tipih napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov in predstavlja dobro izhodišče za nadaljnji razvoj piperazinskih analogov klatrodina in oroidina kot selektivnih modulatorjev 1.3 tipa napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov. Sekundarni metaboliti morskih spužev in njihovih simbiotskih organizmov nastopajo v razmnoževalnih, signalnih, regulacijskih in obrambnih vlogah ter imajo posledično polifarmakološke učinke. Raziskovana alkaloida klatrodin in oroidin iz morskih spužev Agelas sta tako poleg modulacije napetostno odvisnih natrijevih kanalčkov v literaturi opisana kot zaviralca nastanka bakterijskih biofilmov in kot protibakterijski učinkovini. Ker opažamo naraščajoči pojav bakterijske rezistence in upad učinkovitosti že uporabljanih farmakoloških pristopov, smo se v drugem delu doktorskega dela osredotočili na razvoj protibakterijskih učinkovin. Odkrili smo strukturne podobnosti med oroidinom oz. klatrodinom, njunimi piperazinskimi analogi in v literaturi prisotnimi piroloamidnimi zaviralci DNA giraze B. Bakterijska DNA giraza je esencialen encim, ki katalizira uvajanje negativnih zavojev na molekuli DNA oziroma katalizira topološko sproščanje ob podvajanju bakterijske DNA. Podenota B skrbi za hidrolizo molekule ATP in dovaja energijo za funkcionalno delovanje encima. Kjub substratu ATP, encim predstavlja ustrezno in validirano tarčo za razvoj novih protibakterijskih učinkovin. V nasprotju s ključnim aminoimidazolnim fragmentom, ki je bil potreben za modulatorno delovanje piperazinskih analogov oroidina ter klatrodina na napetostno odvisnih natrijevih kanalčkih, smo se pri načrtovanju spojin s potencialnim zaviralnim delovanjem na DNA girazi B osredotočili na piroloamidni oziroma amidni strukturni fragment, katerega smo pri načrtovanih spojinah ohranili. Po naših ugotovitvah ta predstavlja ključni strukturni element, ki omogoča zaviralcem DNA giraze B vzpostavitev vodikovih vezi z aminokislinskimi ostanki v adeninskem žepku ATP vezavnega mesta. Piroloamidna oziroma amidna struktura je pri zaviralcih DNA giraze B podobno povezana preko cikličnih, aromatskih, heteroaromatskih, bicikličnih in kondenziranih cikličnih distančnikov do drugega ključnega strukturnega elementa, ki pa poseduje polarno oziroma kislo funkcionalno skupino. Slednja omogoča drugi ključni kontakt zaviralcev DNA giraze B z bazičnimi argininskimi aminokislinskimi ostanki na vhodu v ATP vezavno mesto. Raziskovana naravna alkaloida in serijo njunih piperazinskih analogov smo uporabili pri in silico metodologiji virtualnega rešetanja in identificirali še aminopiperidinski in cikloheksanski distančnik kot primerna za pripravo knjižnice potencialnih zaviralcev DNA giraze B. Sintetizirali smo več kot 60 spojin treh strukturnih tipov in raziskovali vpliv strukture in konfiguracije uporabljenih distančnikov na zaviralno delovanje izoliranega encima DNA giraze B iz bakterijskega seva E. coli. Poleg centralnega skeleta smo poskušali preučiti tudi optimalno dolžino in velikost terminalnega strukturnega fragmenta z estrsko oziroma karboksilno funkcionalno skupino ter vpliv zamenjave ključnega piroloamidnega fragmenta z večjim indoloamidom. Identificirali in validirali smo pirolo-amino-piperidinski skelet s pripravljenimi spojinami, ki so izkazovale IC50 vrednosti na DNA girazi B v nizkem mikromolarnem območju. Spojina z alifatskim glutaratnim terminalnim fragmentom in pirolo-amino-piperidinskim skeletom pa je izkazovala zaviranje DNA giraze B z IC50 vrednostjo 480 nM. Prav tako smo identificirali primerno konfiguracijo cikloheksanskega distančnika in pripravili spojino s pirolo-1,4-trans-substituiranim cikloheksanskim skeletom in terminalnim glicinskim fragmentom ter IC50 vrednostjo 15.1 μM na DNA girazi B. Na podlagi podatkov vrednotenja encimske inhibicije smo pripravljene piperazinske, piperidinske in cikloheksanske zaviralce DNA giraze B uporabili za študij samega ATP vezavnega mesta. Z in silico metodami molekulskega sidranja in molekulske dinamike smo ocenili sposobnost vezave pripravljenih spojin v ATP vezavno mesto DNA giraze B in preučevali nastanek ključnih interakcij z Asp73 (E. coli številčenje) in bazičnimi argininskimi aminokislinski ostanki na vhodu v vezavno mesto. Preučili smo konformacijo uporabljenih distančnikov in dolžino terminalega fragmenta s karboksilno funkcionalno skupino. Prav tako smo razvili in silico pristop za identifikacijo ključnih ohranjenih molekul vode v ATP vezavnem mestu DNA giraze B ter dodatno potrdili vlogo ohranjene molekule vode pri vzpostavitvi vodikovih vezi med ligandom in adeninskim žepkom v aktivnem mestu DNA giraze B. Spojine s pirolo-amino-piperidinskim skeletom in zaviralnim delovanjem in vitro smo ovrednotili še z metodo površinske plazmonske resonance, kjer smo merili Kd vrednosti zaviralcev pri vezavi na fragment G24, ki je poznan kot najmanjši ATP-vezajoči proteinski fragment giraze B. Za spojine smo izmerili Kd vrednosti od 11 do 12 μM ter potrdili predhodne izmerjene IC50 vrednosti v nizkem mikromolarnem območju. Raziskovalno delo potrjuje obstoječe rezultate in strukturne študije potencialnih zaviralcev DNA giraze B ter omogoča trdne temelje za nadaljnji razvoj ključno potrebnih protibakterijskih učinkovin na terapevtski tarči DNA girazi B. Nadalje smo na podlagi farmakoinformatike identificirali knjižnico 1,3-tiazolidin-4-onov kot potencialnih protibakterijskih učinkovin in s pomočjo in silico podpore molekulskega modeliranja predlagali njihov mehanizem delovanja na encimski tarči undekaprenilpirofosfat sintazi. Spojine smo mikrobiološko ovrednotili ter določili minimalne zaviralne koncentracije na rast petih bakterijskih sevov in glivnega seva C. albicans. Knjižnica je izkazovala protibakterijsko delovanje pri čemer smo spojini (Z)-4-((2-(4-metil-piperidin-1-il)-4-oksotiazol-5(4H)-iliden)metil)benzonitril izmerili MIC vrednost 10 μg/mL na bakterijskem sevu P. aeruginosa.[M. Jukič]20162023-01-11 12:12:05Doktorsko delo/naloga143759sl