Načrtovanje zaviralcev katepsina K in avtolizina s pomočjo pristopov kemometrije in strukturno podprtega načrtovanjaBorišek, Jure (Avtor) Novič, Marjana (Mentor) Zega, Anamarija (Komentor) farmacevtska kemijakatepsin Kavtolizin Ezaviralcibalicatibvrednotenjenačrtovanjekemijska strukturaklinične raziskaveneželeni učinkilizosomotropizemosteoporozazdravljenjekemometrijadisertacijeV raziskavah v sklopu doktorske disertacije smo se posvetili načrtovanju in eksperimentalnemu vrednotenju zaviralcev katepsina K (Cat K) in avtolizina E (AtlE). V prvem sklopu doktorskega dela smo preverili hipotezo, da s pomočjo opisa kemijske strukture zaviralcev Cat K v kompleksu ligand-encim dobimo mehanistično sliko delovanja učinkovine in s tem omogočimo optimizacijo zaviralcev z namenom zmanjševanja neželenih stranskih učinkov. Cat K je lizosomska proteaza, ki igra pomembno vlogo pri nekaterih boleznih, kot so osteoporoza, debelost, diabetes, Pagetova bolezen in ateroskleroza. V zadnjem obdobju so bile raziskave v farmacevtski industriji usmerjene predvsem v razvoj kovalentnih reverzibilnih zaviralcev Cat K za zdravljenje osteoporoze, predvsem tistih z nitrilno oziroma ketonsko funkcionalno skupino. Več zaviralcev Cat K, vključno z balikatibom, je bilo testiranih v kliničnih študijah. Balikatib se je izkazal kot učinkovit zaviralec, vendar so stranski učinki, povezani z lizosomotropizmom, ki je posledica bazičnega značaja balikatiba, onemogočili nadaljnja klinična testiranja. Osnovna spojina vodnica, ki smo jo optimizirali, je bila balikatib, pri kateri so v kliničnih študijah opazili neželene stranske učinke zaradi prevelike bazičnosti substituent na osnovnem skeletu. Najprej smo zgradili validiran kvantitativni model odnosa med strukturo in delovanjem (QSAR) za aminonitrile z benzamidno skupino. Da bi pojasnili izbor strukturnih deskriptorjev, smo uvedli primerjalni indeks prekrivanja/simetrije odzivne površine z izbranimi nivoji v vhodni plasti umetne nevronske mreže. Ugotovili smo, da so pomembni tako deskriptorji, ki so povezani s kovalentnimi vezavnimi parametri v S1 vezavnem žepu, kot tudi deskriptorji, ki opisujejo 3D strukturo molekul in njihovih nekovalentnih interakcij v kompleksu zaviralec-encim v S2 in S3 vezavnih mestih Cat K. V nadaljnjih raziskavah smo z uporabo virtualne kombinatorične knjižnice, QSAR modeliranja in molekulskega sidranja razvili novo serijo zaviralcev Cat K, ki temelji na N-(funkcionaliziranem benzoil)-homociklolevcil-glicinonitrilnem skeletu. Da bi se izognili težavam poznanih zaviralcev Cat K, povezanih z lizosomotropizmom bazičnih spojin in posledično neželenimi učinki, smo na pozicijo P3 vključili šibko bazične oziroma nebazični strukturni fragment. Tri sintetizirane spojine so bile visoko selektivne za Cat K v primerjavi s katepsini L in S z vrednostmi konstante inhibicije (Ki) v območju 10-30 nM. Študije encimske kinetike so pokazale, da imajo novi zaviralci tesen in reverzibilen način vezave na Cat K, medtem ko so kristalne strukture encima v kompleksu z zaviralcem razkrile tako kovalenten kot tudi nekovalenten način vezave med nitrilno skupino zaviralcev in katalitičnim cisteinom Cys25. V drugem delu raziskav smo se posvetili iskanju novih potencialnih zaviralcev AtlE iz bakterijskga seva Staphylococcus aureus (S. aureus). Peptidoglikan, poznan tudi kot murein, je glavna sestavina bakterijske celične stene in je v nenehnem ravnovesnem procesu sinteze in razgradnje, kar je temelj za normalno delovanje bakterijskih celic. Avtolizine uvrščamo v skupino peptidoglikanskih hidrolaz; to so encimi, ki igrajo ključno vlogo pri razgradnji bakterijske celične stene. Med procesom celične delitve so avtolizini odgovorni za ločevanje ekvatorialnega septuma med nastajajočima hčerinskima bakterijskima celicama. Pri mutantih, ki so imeli izbit gen za avtolizine, so se pojavile resne motnje celične delitve, nastale so velike gruče celic, ki niso tvorile biofilma. Bakterijski avtolizini kot potencialne tarče tako predstavljajo še dokaj novo, a obetavno področje raziskav protimikrobnih učinkovin. Kot izhodišče pri načrtovanju potencialnih zaviralcev AtlE smo uporabili še neobjavljeno kristalno strukturo AtlE z vezanim ogljikohidratnim ligandom. Z računalniškimi metodami strukturno podprtega načrtovanja in farmakofornimi modeli smo uspeli dobiti serijo potencialnih zaviralcev, ki imajo afiniteto vezave v nizkem mikromolarnem območju. Pri tem smo uporabili tri glavne pristope racionalnega načrtovanja novih potencialnih zaviralcev AtlE: (1) načrtovanje na osnovi mimetikov sladkorja v kristalni strukturi, (2) načrtovanje na osnovi mimetikov prehodnega stanja glede na teoretični mehanizem katalize substrata in (3) načrtovanje na osnovi zadetkov iz virtualnega rešetanja glede na dostopno kristalno strukturo AtlE. Afiniteto vezave med AtlE in izbranimi spojinami smo določili s površinsko plazmonsko resonanco (SPR) in mikrotermoforezo (MST). Identificirali smo benzamido-piperidinil-ureido-fenilni kemijski razred spojin z afiniteto vezave do AtlE v nizkem mikromolarnem območju. Najbolj obetavne potencialne zaviralce bomo obravnavali v nadaljnjih študijah kristalizacije z AtlE in s celičnimi testi tvorbe biofilma. [J. Borišek]20152023-01-11 10:29:37Doktorsko delo/naloga143753sl