Vloga gama-enolaze pri raku in njeno uravnavanje s proteolitičnimi encimiVižin, Tjaša (Avtor) Kos, Janko (Mentor) rak (medicina)adenokarcinomglioblastomcelične linijegama-enolazakatepsin Xtumorski označevalcirakave celicepreživetjestresni pogojiutišanje genovdiagnostikazdravljenjedisertacijeEncimi glikolitične poti že nekaj časa veljajo za večfunkcijske molekule, ki poleg glikolize izvajajo še številne druge regulatorne funkcije. Gama-enolaza (nevronska specifična enolaza) je encim glikolitične poti, ki se prekomerno izraža v nevrogenih in nevroendokrinih tumorjih in je dobro poznan tumorski označevalec. S svojo glikolitično aktivnostjo prispeva k pospešeni aerobni glikolizi, glavnemu viru energije tumorskih celic. Po drugi strani pa lahko preko dodatnega aktivnega mesta na C-koncu molekule deluje kot dejavnik preživetja, kot je bilo dokazano za nevronske celice. To funkcijo uravnava cisteinska proteaza katepsin X, ki odcepi C-končni dipeptid gama-enolaze. Katepsin X je bil potrjen kot pomemben promotor tumorskega procesa in je v napredovanju raka udeležen preko številnih mehanizmov. Obe molekuli sta prisotni v tumorskih celicah, zato lahko njihova interakcija pomembno vpliva na potek bolezni. Namen doktorskega dela je bil prispevati k razumevanju vloge gama-enolaze kot dejavnika preživetja v rakavih celicah in uravnavanja njenih učinkov s katepsinom X ter opredeliti medsebojno odvisnost, povezanost s kliničnimi in patološkimi parametri in uporabnost obeh molekul v diagnozi raka in napovedi izida bolezni pri bolnikih z rakom. V prvem delu smo na dveh adenokarcinomskih (Caco-2, MCF7) in dveh glioblastomskih (U-87 MG, U-251 MG) celičnih linijah raziskali pomen gama-enolaze v prilagoditvi in preživetju tumorskih celic v stresnih pogojih ter njeno uravnavanje s strani katepsina X. Celice smo izpostavili serumskemu stradanju ali gojišču z dodanim mimetikom hipoksije deferoksaminom in s prenosom po westernu ovrednotili spremembe v izražanju necepljene gama-enolaze (z intaktnim C-koncem) v odvisnosti od proteolitične aktivnosti katepsina X. V vseh analiziranih celičnih linijah se je izražanje necepljene gama-enolaze v primerjavi s celokupno gama-enolazo (necepljeno in cepljeno) bistveno bolj povišalo in je bilo povezano z aktivnostjo katepsina X. Posledično je utišanje izražanja gama-enolaze značilno zmanjšalo preživetje celic v stresnih pogojih. Utišanje gena za katepsin X ali inhibicija njegove proteolitične aktivnosti s specifičnim inhibitorjem AMS36 sta vodila v povišano izražanje necepljene gama-enolaze in posledično se je povečalo tudi preživetje celic v stresnih pogojih. To nakazuje, da je funkcija gama-enolaze kot dejavnika preživetja v rakavih celicah povezana z njeno C-končno necepljeno obliko, ki omogoča prilagajanje tumorskih celic na stresne pogoje; katepsin X pa to delovanje uravnava. Poleg tega smo ugotovili, da katepsin X, ki sicer velja za promotorja tumorskega procesa, zavira zaščitno delovanje gama-enolaze v rakavih celicah, kar nakazuje na njegovo večfunkcijsko vlogo pri raku. V drugem delu smo s prenosom po westernu in testi ELISA ovrednotili izražanje necepljene in celokupne gama-enolaze v različnih rakavih celičnih linijah (glioblastomskih: U-87 MG, U-373 MG, U-251 MG; nevroblastomskih: SH-SY5Y; celic raka debelega črevesa: Caco-2; nerakavih celic dojke: MCF 10A; celic raka dojke: MCF7) ter njuno odvisnost od izražanja in aktivnosti katepsina X. Poleg tega smo raziskali klinično uporabnost necepljene in celokupne gama-enolaze v serumu bolnikov z rakom debelega črevesa in danke. Najprej smo pokazali, da se necepljena gama-enolaza različno izraža v rakavih celičnih linijah, pri čemer je bilo njeno izražanje najvišje v tistih celičnih linijah, ki so bile pridobljene iz metastatskih mest (SH-SY5Y, MCF7) ali zelo invazivnih tumorjev (U-87 MG). Izražanje necepljene gama-enolaze je bilo obratno sorazmerno izražanju katepsina X v celicah, ki je bilo najnižje v bolj invazivnih celicah. Izražanje celokupne gama-enolaze se med različnimi celičnimi linijami ni bistveno razlikovalo. Ugotovili smo, da se gama-enolaza izloča v celični supernatant pretežno v necepljeni obliki in odraža njeno izražanje v celicah. Vrednosti necepljene in cepljene gama-enolaze smo ovrednotili tudi v serumu bolnikov z rakom debelega črevesa in danke. Z imunoprecipitacijo smo preliminarno ugotovili, da je necepljena gama-enolaza prevladujoča oblika tudi v serumu. V 264 serumih bolnikov z rakom debelega črevesa in danke smo s testom ELISA, ki prepoznava samo necepljeno gama-enolazo, in s testom ECLIA (Elecsys NSE Assay, Roche Diagnostics), ki prepoznava celokupno gama-enolazo, izmerili vrednosti obeh. Rezultati so pokazali, da vrednosti različnih oblik gama-enolaze v serumu niso povezane z nobenim kliničnim ali patološkim parametrom. Univariatna analiza preživetja je pokazala, da so višje vrednosti obeh oblik povezane s krajšim preživetjem bolnikov. V skupini bolnikov z metastatskim rakom debelega črevesa in danke (stadij IV), ki niso prejeli paliativne kemoterapije, so bile višje vrednosti obeh oblik značilno povezane s krajšim preživetjem tudi v multivariatni analizi, medtem ko pri bolnikih, ki so prejeli paliativno kemoterapijo, povezave s preživetjem ni bilo. Slednje nakazuje, da vrednosti gama-enolaze v serumu lahko napovejo izid bolezni in odgovor bolnikov z metastatskim rakom debelega črevesa in danke na paliativno kemoterapijo, kar bi bistveno izboljšalo obravnavo bolnikov. Nadaljnje študije na tem področju bi se morale osredotočiti na proučevanje izražanja necepljene gama-enolaze v vzorcih tumorjev, katere bi lahko pokazale dodatne povezave z različnimi kazalci napredovanja raka in omogočile izbor bolnikov z bolj agresivnim tumorskih fenotipom. V zadnjem delu doktorske disertacije smo ovrednotili klinično uporabnost katepsina X v serumu bolnikov z rakom debelega črevesa in danke. V ta namen smo razvili in validirali test ELISA, s katerim smo lahko merili celokupni katepsin X (prokatepsin X in aktivni katepsin X) v serumu. Najprej smo izvedli pilotno klinično študijo, ki je vključevala 77 bolnikov z rakom debelega črevesa in danke, 77 bolnikov, ki so imeli adenome po debelem črevesu, 77 bolnikov brez neoplastičnih sprememb ter 77 zdravih kontrol. Statistično značilnih razlik med posameznimi skupinami nismo opazili, kar pomeni, da celokupni katepsin X nima diagnostične vrednosti, prav tako ni bil povezan z nobenim kliničnim ali patološkim parametrom. Znotraj skupine bolnikov z rakom debelega črevesa in danke pa se je izkazalo, da so višje vrednosti celokupnega katepsina X značilno povezane s krajšim preživetjem bolnikov. Rezultate smo ovrednotili še s potrditveno (264 bolnikov) in validacijsko (460 bolnikov) klinično študijo. Na večjem številu vzorcev se je izkazalo, da so višje vrednosti celokupnega katepsina X značilno povezane s krajšim preživetjem v skupini bolnikov z nemetastatskim rakom (stadiji I-III). Za to skupino je multivariatna Coxova regresijska analiza pokazala močno povezavo med višjimi vrednostmi katepsina X in krajšim preživetjem tistih bolnikov, ki niso prejeli kemoterapije, medtem ko pri bolnikih, ki so prejeli kemoterapijo, razlik v preživetju ni bilo. Vrednosti katepsina X v serumu torej lahko napovejo izid bolezni in odziv na kemoterapijo pri bolnikih z nemetastatskim rakom debelega črevesa in danke, kar uvršča katepsin X med nove obetavne, serumske tumorske označevalce pri bolnikih z rakom debelega črevesa in danke. V okviru doktorskega dela smo prepoznali dodatno vlogo gama-enolaze, ki podpira prilagoditev in preživetje rakavih celic v stresnih pogojih. Razumevanje teh procesov skupaj z zaviranjem njene glikolitične aktivnosti bi predstavljalo nove možnosti pri zdravljenju raka. Prepoznana klinična uporabnost gama-enolaze in katepsina X pa odpira nove možnosti pri odkrivanju in zdravljenju rakavih bolnikov.[T. Vižin]20152023-01-11 08:06:16Doktorsko delo/naloga143732sl