Karakterizacija vezave kalcijevih ionov v kalmodulinu podobno domeno α-aktinina-4 in priprava kristalov za strukturne raziskaveIvanovski, Andrej (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) α-aktinin-4regulacijakalcijkristalizacijastrukturaAktivnost mnogih citosolnih proteinov je odvisna od koncentracije kalcija. Eden izmed pomembnih znotrajceličnih proteinov, ki se odziva na kalcijeve ione, je α-aktinin-4. α aktinini so citoskeletni proteini iz družine spektrinov, ki igrajo povezovalno vlogo med različnimi celičnimi strukturami. Sestavljajo jih štiri regije in sicer aktin vezavna domena, paličasta regija s štirimi spektrinskimi ponovitvami, povezovalna regija “vrat” in kalmodulinu podobna domena. α aktinine delimo na dve skupini glede na njihovo tkivno specifičnost. Mišični izoobliki, α-aktinina 2 in 3, ne vežeta Ca2+-ionov. Po drugi strani ne-mišični izoobliki, α aktinina-1 in -4, vežeta Ca2+-ione, kar vpliva na njuno strukturo in posledično na prostorsko ureditev z njima povezanih aktinskih filamentov. Aktivno obliko α-aktinina-4 predstavlja antiparalelen homodimer z aktin-vezavno domeno na obeh koncih, katerega osrednja vloga je prečno povezovanje aktinskih filamentov v snope in mreže. Za razliko od sorodnega α-aktinina-1 je prisoten tudi v nukleoplazmi, kjer naj bi deloval kot transkripcijski ko-aktivator številnih genov, vpletenih v tumorske spremembe celic. Dosedanje raziskave so pokazale, da vezava Ca2+-iona v kalmodulinu podobno domeno α aktinina-1 sproži konformacijske spremembe v tem delu molekule, ki se po predvidevanjih prenesejo na aktin-vezavo domeno in posledično reorganizacijo aktinskega citoskeleta. Z namenom primerjati Ca2+-vezavne lastnosti ne-mišičnih α aktininov smo se osredotočili na še neokarakterizirano izoobliko 4. V okviru magistrskega dela smo pripravili proteinske kristale dimerne oblike α-aktinina-4, ki vsebuje vse domene udeležene v zgoraj opisani interakciji, ter posneli set difrakcijskih podatkov do ločljivosti 2,9 Å. Z bioinformatsko analizo, kjer smo primerjali zaporedja kalmodulinu podobnih domen različnih izooblik, smo določili tiste aminokislinske ostanke v kalmodulinu podobni domeni α aktinina-4, ki so najverjetneje ključni pri koordinaciji Ca2+ iona. Podobno kot pri α aktininu-1 je tudi pri tej izoobliki pri vezavi Ca2+-ionov aktivna le ena izmed štirih t. i. EF-dlani. Da bi to hipotezo preverili smo v kalmodulinu podobno domeno α aktinina-4 uvedli različne točkovne mutacije, mutantne oblike pa nato okarakterizirali z uporabo izotermne titracijske kalorimetrije. Potrdili smo, da je res aktivno le eno od potencialnih vezavnih mest za Ca2+, afiniteta za vezavo pa je 4-krat nižja kot pri α aktininu-1. Predvidevamo, da je opažena razlika eden izmed faktorjev, ki vplivajo na različno obnašanje teh dveh izooblik ter posledično na njuno različno preferenčno vključenost v citoskeletne strukture kot so fokalni stiki in ukrivljene membranske strukture.20222022-12-12 15:15:00Magistrsko delo/naloga143285sl