Racionalno načrtovanje in priprava dimernih variant človeškega katepsina BPutar, Erik (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) oligomerizacijaproteinski inženiringkatepsiniNamen proteinskega inženiringa je priprava mutantnih proteinov, ki so v primerjavi z izvirnikom izboljšani ali kakorkoli modificirani v skladu z našimi potrebami. V okviru diplomske naloge smo z racionalnim pristopom proteinskega inženiringa želeli pripraviti homodimerno varianto človeškega katepsina B, ki je sicer monomerna papainu podobna cisteinska peptidaza. V naravi se proteini namreč nahajajo predvsem v homodimerni in homotetramerni obliki zaradi manjše topilu dostopne površine, ki poveča njihovo stabilnost. V primeru encimov lahko z oligomerizacijo potencialno izboljšamo njihovo afiniteto do substratov in hkrati dosežemo višjo lokalno koncentracijo aktivnih mest. Z uporabo prostodostopnih bioinformatskih orodij smo identificirali potencialne interakcijske ostanke na površini katepsina B ter z molekulskim umeščanjem in silico ustvarili model homodimera, ki je v stični površini med podenotama vseboval identificirane ostanke. Stično površino smo optimizirali z uvedbo treh hidrofobnih substitucij (H45W, N149F in K166W), s katerimi smo izboljšali stabilnost kompleksa ter povečali zakopano površino med podenotama. S simulacijami molekulske dinamike smo potrdili, da v vodnem topilu načrtan trojni mutant tvori stabilen homodimer. In silico ugotovitve smo nato želeli ovrednotiti še in vitro. Z mestno-specifično mutagenezo smo pripravili tri mutantne zapise za človeški prokatepsin B. Prvi je vseboval mutacijo za substitucijo K166W (enojni mutant), drugi K166W ter H45W (dvojni mutant) in tretji K166W, H45W ter N149F (trojni mutant). Vse tri mutante smo uspešno izolirali v topni obliki ter jim po aktivaciji določili njihove Michaelis-Mentenine konstante za sintetični substrat Z-FR-AMC (25 °C, 100 mM NaOAc, pH 5,5, 1mM EDTA, 5 mM DTT): 136 ± 10 µM za enojnega mutanta, 55 ± 6 µM za dvojnega mutanta in 45 ± 4 µM za trojnega mutanta. V zadnjem delu diplomske naloge smo z gelsko izključitveno kromatografijo poskusili določiti oligomerno stanje aktiviranih mutantov, kjer smo samo za enojnega mutanta nedvoumno lahko trdili, da se nahaja v monomerni obliki.20222022-11-30 13:05:00Diplomsko delo/naloga142887sl