Novi farmakološki pristopi za blokado nevtrofilnih zunajceličnih pastiMiholič, Marta (Avtor) Čučnik, Saša (Mentor) Simon, Hans - Uwe (Komentor) nevtrofilne zunajcelične pastiproteini SNAREoksidaza NADPHpunicalaginNevtrofilci so del prirojenega imunskega sistema, kjer igrajo vlogo pri prepoznavanju in odstranjevanju za gostitelja potencialnih povzročiteljev bolezni. Zaradi njihove granulirane citoplazme in segmentiranega jedra jih uvrščamo v skupino granulocitov. Vsebujejo štiri tipe zrnc, in sicer primarne (azurofilne), sekundarne (specifične), terciarne (gelatinazne) granule ter sekretorne vezikle. Te vsebujejo različne antimikrobne encime, ki jih lahko aktivirani nevtrofilci med procesom eksocitoze sprostijo v zunajcelični prostor. Poleg eksocitoze, nevtrofilci svojo protimikrobno vlogo opravljajo še preko oksidativnega izbruha in izgradnje zunajceličnih nevtrofilnih pasti. Zunajcelične nevtrofilne pasti nastanejo, ko nevtrofilci poleg granul v zunajcelični prostor sprostijo še DNA. Čeprav vpletenosti jedrne DNA ne moremo popolnoma izključiti, obstajajo znatni dokazi, da je DNA, ki sodeluje pri nastanku zunajceličnih nevtrofilnih pasti, mitohondrijskega izvora. Nastale pasti imajo sposobnost ujeti in odstraniti različne patogene. Predhodne raziskave navajajo, da nevtrofilci za uspešno izgradnjo zunajceličnih nevtrofilnih pasti potrebujejo energijo v obliki ATP, delujoč citoskelet ter proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti. Klub temu mehanizem, po katerem nevtrofilci sprostijo mitohondrijsko DNA, ostaja nepoznan. Cilj naloge je bil raziskati vlogo proteinov SNARE pri izgradnji zunajceličnih nevtrofilnih pasti. Proteini SNARE sodelujejo pri zlivanju membran in jih glede na to, kje v celici se nahajajo, delimo na proteine t-SNARE, ki se nahajajo na tarčni membrani, in proteine v-SNARE, ki se nahajajo na membrani veziklov. Proteini t-SNARE in v-SNARE medsebojno sodelujejo in tvorijo sveženj štirih vijačnic, ki omogoči približanje vezikla in tarčne membrane ter njuno zlitje. Humani nevtrofilci izražajo različne proteine SNARE, ki sodelujejo pri eksocitozi granul. Na celični membrani se prevladujoče nahajajo Syntaxin-4, Syntaxin-6 in SNAP-23, a slednjega najdemo tudi na membrani sekundarnih in terciarnih granul. Membrana sekretornih veziklov, sekundarnih in terciarnih granul vsebuje predvsem VAMP-2, medtem ko eksocitozo primarnih granul posredujeta predvsem VAMP-1 in VAMP-7. Z namenom preučitve vpletenosti proteinov SNARE pri izgradnji zunajceličnih nevtrofilnih pasti, smo izolirane humane nevtrofilce za 30 minut izpostavili prisotnosti dveh fuzijskih proteinov TAT, TAT-Syntaxina-4 (5 µg/ml) in TAT-SNAP-23 (5 µg/ml), s katerima smo preprečili vezavo endogenih proteinov SNARE in nastanek kompleksa SNARE, ki je potreben za fuzijo membran. Izolirane nevtrofilce smo nato aktivirali s granulocitno-makrofagne kolonije stimulirajočim faktorjem (100 ng/mL) in komponento komplementa C5a (10 nM). Z uporabo spektrofluorometra in barvila PicoGreen smo v celičnih supernatantih izmerili kinetiko količine sproščene dvojnoverižne DNA. Nasprotno našim pričakovanjem, smo opazili, da je le dodatek TAT-Syntaxina-4 povzročil signifikantno zavrtje sprostitve dvojnoverižne DNA, in sicer 15 in 45 minut po stimulaciji z GM-CSF/C5a. Dodatno smo z uporabo označenih protiteles in pretočne citometrije izmerili kinetiko spremembe v ekspresiji določenih antigenov na celični membrani, s čimer smo določili raven eksocitoze primarnih (CD63) in sekundarnih granul (CD66b) ter sekretornih veziklov (CD35). Naši rezultati potrjujejo predhodne ugotovitve, da sta Syntaxin-4 in SNAP-23 vpletena v proces degranulacije. Dodatek TAT-Syntaxina-4 in TAT-SNAP-23 je namreč signifikantno znižal eksocitozo tako primarnih kot sekundarnih granul že 2 minuti po stimulaciji z GM-CSF/C5a. Kljub temu nismo opazili statistično značilnega učinka na eksocitozo sekretornih veziklov. Za oceno kinetike proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti, ki je glede na dosedanja odkritja potrebna za nastanek zunajceličnih nevtrofilnih pasti, smo celicam dodali dihidrorodamin 123, ter s pretočno citometrijo izmerili aktivnost reaktivnih kisikovih zvrsti. Rezultati omenjenega testa so pokazali, da je dodatek TAT-Syntaxina-4 signifikantno zavrl proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti že 10 minut po stimulaciji z GM-CSF/C5a. Nasprotno, dodatek TAT-SNAP-23 ni imel statistično značilnega učinka na proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega je dodatek obeh fuzijskih proteinov TAT hkrati povzročil še znatnejše zavrtje proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti že 5 minut po stimulaciji z GM-CSF/C5a. Glavni vir proizvedenih reaktivnih kisikovih zvrsti v nevtrofilcih predstavlja oksidaza NADPH, encim, ki ga sestavljata dve membransko vezani podenoti (gp91phox and p22phox) in štiri citosolne podenote (p40phox, p47phox, p67phox in Rac2). Splošno znano je, da se 90 % podenote gp91phox nahaja na membrani granul, zato smo predpostavili, da z dodatkom TAT-Syntaxina-4 in TAT-SNAP-23 preprečimo premestitev membransko vezanih podenot na celično membrano, ter tako vplivamo na količino proizvedenih kisikovih reaktivnih zvrsti. Našo hipotezo smo preverili tako, da smo neaktivirane kot aktivirane nevtrofilce, ki smo jim predhodno dodali TAT-Syntaxin-4 in TAT-SNAP-23, obarvali s fluorescenčno označenimi protitelesi za membransko komponento gp91phox, citosolno komponento p47phox ter mieloperoksidazo, sestavino primarnih granul, ter jih preučili s konfokalnim mikroskopom. Slike neaktiviranih nevtrofilcev v odsotnosti fuzijskih proteinov TAT so pokazale enakomerno razporeditev gp91phox, p47phox in mieloperoksidaze po celici, medtem ko so slike aktiviranih nevtrofilcev pokazale povečano premestitev gp91phox, p47phox in mieloperoksidaze k celični membrani. Presenetljivo, pri aktiviranih nevtrofilcih, ki smo jim dodali fuzijska proteina TAT, nismo opazili manjše kolokalizacije podenot oksidaze NADPH v primerjavi z neobdelanimi aktiviranimi nevtrofilci. Nasprotno, opazili smo večji delež kolokalizacije podenot oksidaze NADPH. V drugem delu naloge, smo želeli preučiti vlogo punicalagina pri izgradnji zunajceličnih nevtrofilnih pasti. Punicalagin je glavna komponenta olupka granatnega jabolka in spada v družino elagitaninov. Znan je po svoji sposobnosti lovljenja reaktivnih kisikovih zvrsti ter ohranjanja integritete celične membrane. Z namenom preučitve njegovega vpliva na proizvodnjo zunajceličnih nevtrofilnih pasti, smo v njegovi prisotnosti (50 µM) izmerili količino sproščene dvojnoverižne DNA, stopnjo degranulacije ter proizvodnjo reaktivnih kisikovih zvrsti. Rezultati so nedvoumno pokazali, da dodatek punicalagina popolnoma zavre sprostitev dvojnoverižne DNA že 10 minut po stimulaciji z GM-CSF/C5a. Še več, že 2 minuti po stimulaciji z GM-CSF/C5a smo opazili signifikantno znižanje eksocitoze primarnih granul in skoraj popolno zavrtje eksocitoze sekretornih veziklov. Kljub temu nismo opazili statistično značilnega učinka na eksocitozo sekundarnih granul. Poleg tega nismo opazili statistično značilnih razlik v proizvodnji kisikovih reaktivnih spojin med aktiviranimi nevtrofilci in aktiviranimi nevtrofilci v prisotnosti punicalagina. Za ovrednotenje delovanja njegovega mehanizma smo s konfokalno mikroskopijo preučili polimerizacijo aktina mirujočih in aktiviranih nevtrofilcev, v odsotnosti ali prisotnosti punicalagina. Po pričakovanjih smo pri mirujočih nevtrofilcih opazili obroč vlaken aktina, medtem ko so aktivirani nevtrofilci izkazovali razpršeno tvorbo aktinskih vlaken. Čeprav ni bilo razlike med aktiviranimi nevtrofilci v prisotnosti ali odsotnosti punicalagina, smo pri mirujočih nevtrofilcih v prisotnosti punicalagina opazili podobno polimerizacijo aktina kot pri stimuliranih nevtrofilcih. V nadaljevanju smo s konfokalno mikroskopijo preučili še preureditev mikrotubulov mirujočih in aktiviranih nevtrofilcev, v odsotnosti in prisotnosti punicalagina. Po pričakovanjih smo pri nestimuliranih nevtrofilcih opazili glavni organizacijski center mikrotubulov, medtem ko so aktivirani nevtrofilci izkazovali vzpostavljeno mrežo mikrotubulov. Presenetljivo, smo zopet opazili vzpostavljeno mrežo mikrotubulov že pri nestimuliranih nevtrofilcih obdelanih s punicalaginom, medtem ko med aktiviranimi nevtrofilci v prisotnosti in odsotnosti punicalagina nismo opazili razlik.20222022-11-10 08:45:01Magistrsko delo/naloga142461sl