Uporaba haloalkan dehalogenaze za označevanje variant MLKL v celičnih linijah HEKZaveršek, Nika (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) MLKLnekroptozaHaloTag7konfokalna fluorescenčna mikroskopijaProtein MLKL (angl. mixed-lineage kinase domain-like) je izvršilec nekroptoze, vrste regulirane celične smrti. Sestavljen je iz psevdokinazne domene in domene svežnja štirih vijačnic (4HB), ki ima izvršilno funkcijo. Študije so pokazale, da vijačnica v povezovalnem delu med domenama inhibira domeno 4HB. Uporabili smo štiri variante hMLKL1: celotno hMLKL1, skrajšano varianto hMLKL1 iz N-končnih 154 aminokislinskih ostankov in obe varianti z mutacijo D144K, ki aktivira hMLKL1. Fluorescenčne oznake so uporabno orodje pri opazovanju celične lokalizacije proteinov. Med najbolj znane fluorescenčne oznake sodi EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein), ena izmed novejših in zanimivih oznak je HaloTag7, ki veže organska barvila na kloroalkanskem distančniku. Zanimalo nas je, kako proteinski oznaki HaloTag7 in EGFP vplivata na funkcijo hMLKL1 in njegovih variant, ter katera je boljša za opazovanje hMLKL1 in njegovih oznak z mikroskopom. Pripravili smo stabilne celične linije HEK293 z vstavljenimi variantami hMLKL1 in proteinskima oznakama EGFP in HaloTag7. Ugotovili smo, da EGFP in HaloTag7 na funkcijo hMLKL1 in njegovih variant vplivata minimalno, pri čemer je vpliv EGFP manjši. Presodili smo, da je EGFP bolj primeren za opazovanje hMLKL1 v celičnih linijah HEK293 s konfokalnim fluorescenčnim mikroskopom. Pri hMLKL1 variantah z mutacijo in obema proteinskima oznakama je bila očitna translokacija na membrano.20222022-10-12 12:00:00Magistrsko delo/naloga141951sl