Karakterizacija imunskega odziva mišjih tumorjev na obsevanje z večbarvnim imunofluorescenčnim barvanjemKozjek-Mencinger, Lucija (Avtor) Serša, Gregor (Mentor) Markelc, Boštjan (Komentor) Čemažar, Maja (Recenzent) magistrska delaradiološka tehnologijarakmišji tumorski modelitumorsko mikrookoljeimunski sistemobsevanjevečbarvno imunofluorescenčno barvanjeUvod: Rak je bolezen oziroma skupek bolezni za katere je značilna nenadzorovana rast in delitev celic. V zadnjem času se velik pomen v razvoju tumorja pripisuje tumorskemu mikrookolju. Stopnja ter vrsta infiltracije imunskih celic v tumorsko tkivo lahko vpliva na potek bolezni in učinkovitost terapij, zato je pomembno dobro poznavanje sestave tumorskega mikrookolja ter kako se le to spreminja zaradi delovanja terapij. Namen: Namen magistrske naloge je bil z uporabo večbarvnega imunofluorescenčnega barvanja ugotoviti, do kakšnih sprememb pride v tumorskem mikrookolju mišjih tumorskih modelov raka debelega črevesa CT26 in raka dojke 4T1 po obsevanju in kako obsevanje vpliva na zaostanek v rasti tumorja v primerjavi z ne-obsevanimi tumorji. Metode dela: V magistrski nalogi smo uporabili metodo večbarvnega imunofluorescenčnega barvanja v kombinaciji s konfokalno mikroskopijo, ki se je izkazala kot učinkovita metoda za preučevanje tumorskega mikrookolja in odziva na različne terapije. Z njo lahko sočasno opazujemo različne populacije celic, ki so prisotne v tumorskem mikrookolju. Uporabili smo dva tumorska modela: CT26 (mišji tumorski model raka debelega črevesa) in 4T1 (mišji tumorski model raka dojke). Eksperiment je vključeval obsevanje tumorjev z enkratno dozo 10 Gy ali frakcionirano dozo 3 x 5 Gy. Z barvanjem smo prikazali krvne žile, imunske celice, natančneje limfocite T CD4 in CD8 (celice CD4 oz. celice pomagalke, celice CD8 oz. celice ubijalke), makrofage in celična jedra, ki smo jih obarvali z barvilom Hoechst 33342. Protitumorski učinek obsevanja so določali s spremljanjem zaostanka v rasti podkožnih tumorjev po terapiji, in sicer z merjenjem prostornine tumorja z Vernierjevim merilnikom. Rezultati: Rezultat eksperimenta so slike in grafi (za vsako terapijo posebej). Slike smo zajemali s konfokalnim mikroskopom ZEISS LSM 800 in analizirali s programom za analizo slik Imaris. Analizo ter statistično obdelavo pridobljenih podatkov smo izvedli v programu GraphPad Prism. Uporabili smo enosmerno analizo variance ANOVA, neparni t test in Mann-Whitney U test. Obsevanje z 10 Gy in 3 x 5 Gy je povzročila spremembe v tumorskem mikrookolju in vplivala na zaostanek v rasti tumorja v primerjavi z ne-obsevanimi tumorji. Število celic CD4 in CD8 se je tretji dan po terapiji z 10 Gy pri tumorskem modelu 4T1 in sedmi dan po terapiji s 3 x 5 Gy pri tumorskem modelu CT26 povečalo. Do povečanja števila celic CD8 je prišlo tudi sedmi dan po terapiji z 10 Gy pri tumorju 4T1. Število žil se je pri tumorskem modelu 4T1 tretji dan po terapiji z 10 Gy povečalo. Pri vseh ostalih primerih tako pri CT26 kot 4T1 pa se je število celic CD4 in CD8 zmanjšalo, prav tako tudi število krvnih žil. Razprava in zaključek: V raziskovalni nalogi smo prikazali, da je metoda večbarvnega imunofluorescenčnega barvanja primerna za pridobitev informacij o sestavi tumorskega mikrookolja. Pokazali smo, da obsevanje povzroči spremembe v tumorskem mikrookolju saj se je po obsevanju spremenilo število preiskovanih imunskih celic v tumorju, s čimer smo potrdili našo drugo hipotezo. Obsevanje tumorjev je tudi povzročilo zaostanek v njihovi rasti v primerjavi z ne-obsevanimi tumorji s čimer smo potrdili našo prvo hipotezo. Poznavanje dinamike infiltracije imunskih celic v tumorsko tkivo bo pomagalo pri razumevanju mehanizmov odziva tumorja na terapijo ter pri nadaljnji optimizaciji kombiniranih terapij.[L. Kozjek Mencinger]20222022-10-05 07:45:34Magistrsko delo/naloga141688sl