Izolacija amiloidnega proteina TasA bakterije Bacillus subtilisSušec, Ana (Avtor) Dogša, Iztok (Mentor) biofilmamiloidni proteinprotein TasAizolacija rekombinantega proteinadetekcija proteinovV magistrskem delu smo optimizirali postopek izolacijo funkcionalnega amiloidnega proteina TasA, ki je pomemben gradnik biofilma bakterije Bacillus subtilis. Protein smo izolirali iz celic rekombinantnega seva Escherichia coli, ki z uporabo induktorja lac operona producira rekombinanto obliko TasA. Protein TasA je lahko v monomerni ali fibrilarni obliki, pri čemer velja, da ima fibrilarna oblika ključno vlogo pri nastanku biofilma. TasA omogoča adhezijo celic na površino, ustvarja medcelične povezave in daje hkrati biofilmu mehansko stabilnost. Optimizacija izolacijskega postopka je potekala na osnovi spreminjanja komponent gojišča in induktorja na način, ki je omogočal pridobitev čim večje gostote celic v stresani kulturi in s tem tudi večje mase tarčnega proteina. Ugotovili smo, da je bila izolacija najbolj učinkovita v primeru gojenja celic v optimiziranem indukcijskem gojišču, ki vsebuje MgSO4, in ob uporabi induktorja izopropil beta-D-1-tiogalaktopiranozid Spremljali smo tudi spremembe v celični gostoti v odvisnosti od aeracije celične kulture in deležu inokuluma. Za najboljši način gojenja se je izkazalo stresanje 200 mL kulture v 500 mL erlenmajerici z utori in dodanim 1 % inokulumom. V naslednjem koraku smo morali suspenzijo E. coli sonicirati, saj je rekombinantni TasA znotrajcelični protein. Najustreznejši način izvedbe sonikacije za biomaso iz 1 L bakterijske kulture je trajal 40 min s 30 sekundnimi intervali in s 15 mikronsko amplitudo moči sonikacije. Želeli smo tudi pridobiti protein s čim manj prisotnih nečistoč, zato smo optimizirali čiščenje rekombinantnega proteina z uporabo GST kroglic, TEV proteaze in Ni-NTA kroglic. Pri interpretaciji z UV-VIS spektrofotometrom izmerjene koncentracije izoliranega proteina smo si pomagali z SDS-PAGE elektroforezo, s katero smo lahko potrdili identiteto vzorca, torej prisotnost očiščenega proteina TasA.[A. Sušec]20222022-10-01 07:15:33Magistrsko delo/naloga141539sl