Biokemijska karakterizacija od kalcija neodvisne metakaspaze tipa II iz vrste bombaževca Gossypium raimondiiJenko, Anže (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) metakaspaze tipa IIcisteinske proteazeGossypium raimondiiregulirana celična smrtRegulirana celična smrt (RCD) je evolucijsko ohranjen mehanizem, ki je pomemben tako pri odzivu na stres kot tudi pri rasti in razvoju organizma. Pri poteku RCD pri živalskih celicah so ključne cisteinske endopeptidaze kaspaze, ki pa jih pri preostalih organizmih ni. Na morfološki ravni so RCD opazili tudi pri višjih rastlinah. Za to naj bi bila odgovorna kompleksna signalna pot, kjer pride do usklajenega delovanja različnih proteaz. Med proteazami, ki bi lahko bile ključne pri tem procesu, naj bi bile tudi metakaspaze, ki so strukturno homologne živalskim kaspazam. Kljub enakemu tipu zvitja, se kaspaze in metakaspaze v nekaterih funkcijskih lastnostih razlikujejo. Kaspaze za svojo aktivacijo potrebujejo dimerizacijo ter cepijo svoje substrate zgolj za kislimi aminokislinskimi ostanki, medtem ko metakaspaze cepijo substrate za pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki ter so aktivne v monomerni obliki, za svojo aktivacijo pa v splošnem potrebujejo kalcijeve ione. Izjema so nekatere izmed metakaspaz tipa II, ki kalcija za svoje delovanje ne potrebujejo ter so aktivne zgolj pri vrednostih pH v rahlo kislem območju. Predmet našega raziskovanja je bila metakaspaza GrMCA-IId iz vrste bombaževca Gossypium raimondii. Ta metakaspaza je strukturno atipična, saj je njeno delovanje od kalcija neodvisno, poleg tega pa je do sedaj prvo opažena metakaspaza, ki jo sestavljata dva segmenta s kaspaznim/hemoglobinaznim zvitjem in je torej nekakšen približek dimera, ki je sicer značilen za kaspaze. Glavni cilj tega dela je bil izraziti, očistiti in okarakterizirati metakaspazo GrMCA-IId ter oba ločena segmenta. Zaradi nezadostno dobljene količine GrMCA-IId celotne dolžine smo za karakterizacijo uporabili le rekombinantno izražena posamezna segmenta oz. polovici; GrMCA-IId (P1) ter GrMCA-IId (P2). Z različnimi encimskimi testi smo ugotovili, da sta obe polovici optimalno katalitično aktivni pri rahlo kislem pH. Obe proteazi pri takšnem pH uspešno cepita tako proteinski substrat β-kazein kot tudi majhna sintetična substrata Z-FR-AMC in Z-RR-AMC, kjer je vrednost Michaelisove konstante v splošnem nižja pri uporabi substrata Z-RR-AMC. Poleg tega smo pri obeh polovicah opazili, da ob izpostavitvi kislemu okolju poteče specifična avtoproteolitska cepitev znotraj posamezne polipeptidne verige, vendar pa ta proces pri GrMCA-IId (P2) poteče precej počasneje kot pri GrMCA-IId (P1). Zanimalo nas je tudi, če se obe polovici spontano povežeta v kompleks preko nekovalentnih interakcij, vendar pa tega z izvedbo gelske filtracije pri izbranih pogojih nismo zaznali. Na podlagi opažanj iz uporabljenih encimskih testov, smo ugotovili, da si obe polovici med seboj katalitično nista zelo podobni, saj je GrMCA-IId (P2) precej slabše aktivna od GrMCA-IId (P1). S poravnavo zaporedij kot tudi pri pripravi modelov struktur v programu Alphafold nismo opazili konkretnih razlik, ki bi lahko bile odgovorne za takšno razliko v delovanju obeh polovic, seveda pa obstaja odprto vprašanje, kako delujeta in sodelujeta obe polovici v GrMCA-IId celotne dolžine20222022-09-30 10:00:00Magistrsko delo/naloga141513sl