Analiza novih molekularnih poti in genov povezanih z eritrocitozoVičič, Ana (Avtor) Debeljak, Nataša (Mentor) Družinska eritrocitozaidiopatska eritrocitozaanaliza genske interakcijesekvenčna analizaHIF1A.Eritrocitoza je bolezensko stanje, za katero je značilna kronično povišana količina rdečih krvnih celic (eritrocitov) in povišana raven hematokrita ter hemoglobina. Glede na to, kje je motnja, ločimo primarno in sekundarno eritrocitozo, glede na vzrok razvoja bolezni pa pridobljeno in prirojeno. Najpogosteje je eritrocitoza posledica ne-genetskih zunanjih dejavnikov ali drugih kroničnih bolezni, redkeje pa pridobljenih ali prirojenih različic v nukleotidnem zaporedju. Družinska eritrocitoza (ECYT) je redka prirojena hematološka bolezen. Diagnosticiramo jo z analizo nukleotidnega zaporedja devetih genov vključenih v uravnavanje eritropoeze (EPOR, EPO), homeostazo zaznavanja kisika (VHL, EGLN1, EPAS1) in afiniteto vezave kisika na hemoglobin (HBB, HBA1, HBA2 in BPGM). Več kot 60 % bolnikov s sumom na ECYT ostaja neopredeljenih (idiopatska eritrocitoza), saj genetskega ozadja ne moremo pojasniti s trenutno diagnostično metodo. Visok delež neopredeljenih bolnikov kaže, da obstajajo še ne poznani potencialni geni in molekularni mehanizmi, vključeni v razvoj eritrocitoze. V prvem delu naloge smo s pregledom podatkovnih zbirk STRING in Reactome iskali interakcijske partnerje že znanih genov, vpletenih v eritrocitozo. Za vsak na novo opredeljen interakcijski partner smo na podlagi števila interakcij z različnimi tarčnimi geni ocenili njegov potencialen prispevek za razvoj eritrocitoze. Največje število interakcij (4) so imeli GRB2, SOCS3 in JAK2, drugo največje število interakcij (3) pa so imeli EP300, HIF1A, HIF3A, PLCG1, CBL, KIT, STAT5A in PTPN6. V drugem delu smo optimizirali metodo PCR za pomnoževanje in sekvenčno analizo nukleotidnega zaporedja 12. eksona gena HIF1A. Slednjega smo izbrali na podlagi bioinformacijske analize, v kateri je bil HIF1A eden izmed genov z maksimalnim številom eksperimentalno potrjenih interakcij s tarčnimi geni. Pomembna je bila tudi analiza literature, ki je pokazala povezavo med specifičnimi genetskimi različicami v 12. eksonu HIF1A in simptomi eritrocitoze. Optimalna reakcija PCR z izbranim parom začetnih oligonukleotidov (HIF1A-int11F-1 in HIF1A-int12R-1) je bila brez dodatkov, s temperaturo prileganja 65 °C, časom podaljševanja 15 s in 30 cikli. Optimizirana metoda PCR bi lahko bila uporaben dodatek k rutinskemu diagnostičnemu postopku opredelitve ECYT v Sloveniji, ki bi nekoliko povečal sposobnost opredelitve vzroka bolezni in s tem izbor ustreznega zdravljenja.20222022-09-15 14:10:00Diplomsko delo/naloga140538sl