Racionalno načrtovanje in priprava dimernih variant človeškega katepsina SSotošek, Timotej (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) Cisteinski katepsinikatepsin Sproteinski inženiringVečina celičnih proteinov je oligomerov. Oligomerni proteini imajo namreč manjšo topilu dostopno površino kot monomeri, s tem pa se poveča njihova stabilnost. Hkrati lahko z oligomerizacijo zvišamo lokalno koncentracijo aktivnih mest in tako izboljšamo aktivnost encima. Kljub pogostosti oligomernih proteinov je katepsin S, pripadnik papainu podobnih cisteinskih proteaz, monomer. V sklopu naše diplomske naloge smo želeli z uporabo bioinformatskih orodij določiti potencialne interakcijske ostanke in uvesti substitucijske mutacije na površini katepsina S, ki bi posledično tvoril stabilen homodimer. V prvem delu naloge smo z uporabo različnih javno dostopnih programov določili interakcijske ostanke na površini katepsina S ter določili površinske substitucije aminokislin, ki bi povzročile spontano homodimerizacijo. S progrmom HADDOCK 2.4. smo določili predvideno strukturo homodimera, zakopano površino in interakcijsko energijo. S tremi točkovnimi mutacijami aminokislin (E15Y, P91W, K93W) smo uspeli povečali zakopano površino na 2478,8 Å 2 ter izboljšali interakcijsko energijo homodimera, s čimer smo ga stabilizirali Z računanjem molekulske dinamike smo dokazali, da teoretično mutiran katepsin S (E15Y, P91W, K93W) z oznako MutS5 na začetku tvori stabilen dimer, ki pa s časom postaja vse manj stabilen. To smo želeli preveriti v praksi, zato smo izvedli še eksperimentalni del. V ekperimentalnem delu smo z mestno-specifično mutagenezo uvedli mutacije v DNA zapis za prokatepsin S vključen v plazmid pET-32/28b(+) in tega transformirali v Rosetta Gami II [DE3] pLysS za ekspresijo proteina MutS5. Z NaDS-PAGE smo dokazali, da se naš mutirani protein izraža predvsem v netopni obliki, kar pomeni, da se je najverjetneje narobe zvil zaradi mutacij. V takšni obliki ne moremo dokazati, da pravilno zviti MutS5 tvori homodimer in pri tem ostane aktiven.20222022-09-09 13:55:00Diplomsko delo/naloga140027sl