Izražanje in karakterizacija sintetične samosestavljajoče se proteinske kletke, zgrajene iz svežnjev α-vijačnic in β-propelerskega zvitjaLokar, Martina (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) sintetični protein Pizza-α-vijačniciproteinska kletkaoligomerni kompleksSintetični proteini, ki jih lahko pridobimo s preoblikovanjem obstoječih nativnih proteinov ali z de novo sintezo, se v zadnjih letih zaradi svojih lastnosti vedno pogosteje uveljavljajo v številnih biotehnoloških in terapevtskih aplikacijah. Umetno oblikovani proteini s specifično tridimenzionalno strukturo in funkcijo so med drugim pomembni kot modulatorji imunskega sistema, samosestavljajoči se biomateriali ali kot senzorji v raznolikih biotehnoloških sistemih. Njihovo načrtovanje in sinteza omogočata tudi boljše razumevanje osnovnih principov proteinskega zvijanja in povezav med tridimenzionalno strukturo ter funkcijo proteina. Primer sintetičnega proteina je Pizza α vijačnici, ki je zgrajen iz tretjine proteina Pizza2-SR z β propelerskim zvitjem in svežnja dveh α-vijačnic proteina DF1-L13A. Na podlagi predvidene strukture proteina Pizza-α-vijačnici predpostavljamo, da proteinski monomeri med seboj spontano interagirajo in tvorijo samosestavljajoč se heksamerni kompleks v obliki tristrane prizme, imenovan tudi proteinska kletka Pizza α vijačnici. Do interakcij med monomeri prihaja s trimerizacijo regije z β-propelerskim zvitjem, sočasno pa v prisotnosti dvovalentnih kovinskih ionov antiparalelno dimerizirata tudi svežnja dveh α-vijačnic. Cilj magistrskega dela je bil pripraviti plazmidni konstrukt z ustreznim zapisom za sintetičen protein Pizza α vijačnici, v nadaljevanju protein izraziti v bakterijah in ga iz bakterijskih celic izolirati v čisti obliki. Z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo uspeli pripraviti dva konstrukta proteina Pizza-α-vijačnici (Pizza 2hx-AM in Pizza 2hx bM), ki smo ju v nadaljevanju izrazili in izolirali s kovinskokelatno afinitetno kromatografijo (IMAC). V drugem delu smo na osnovi kromatografije z ločevanjem po velikosti (SEC) dokazali, da je protein Pizza 2hx AM pri različnih pufrskih pogojih v ravnotežju med več različnimi oligomernimi stanji. Določili smo, da je največ heksamernega kompleksa v raztopini prisotnega ob dodatku nizke koncentracije kelatorja kovinskih ionov EDTA. Te ugotovitve smo dodatno potrdili z nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo (nativni PAGE), prečnim povezovanjem z glutaraldehidom in sledečo poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS PAGE) ter z določanjem molekulske mase proteinskih kompleksov na podlagi multidetektorskega sistema. S SEC smo tudi določili, da proteinski konstrukt Pizza 2hx-bM ne oblikuje heksamernega kompleksa. Na koncu smo želeli predvideno tridimenzionalno strukturo heksamera Pizza α-vijačnici dokončno potrditi z rentgensko kristalografijo, vendar nam pri kristalizacijskem eksperimentu ni uspelo pridobiti dovolj velikih kristalov, da bi bili primerni za rentgensko kristalografsko analizo.20222022-09-09 13:15:00Magistrsko delo/naloga140018sl