Priprava ter karakterizacija metaloproteaze Mpl iz patogene bakterije Listera monocytogenesKorošec, Sara (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) metaloproteazaListeria monocytogenesMplpro-encimtopnostBakterija Listeria monocytogenes je znotrajcelični patogen, ki prehaja med celicami in se deli v citosolu gostiteljske celice. Znotrajcelični cikel zajema pobeg iz vakuole, pri čemer sodeluje več virulentnih faktorjev, med drugim metaloproteaza Mpl. Gre za slabo raziskan bakterijski protein, zato smo se odločili za izolacijo in karakterizacijo. Pripravili smo več različnih konstruktov, ki so se med seboj razlikovali po afinitetni oznaki, prisotnosti signalnega zaporedja in pro- ali zreli obliki Mpl. Začetni pogoji gojenja bakterijskih celic in izražanja proteina so pokazali, da se rekombinanten proMpl izraža, a se nahaja v netopni frakciji, medtem ko izražanja zrele oblike Mpl nismo opazili. Cilj je postal pridobiti topno obliko proMpl. K temu izzivu smo pristopali sistematsko, tako da smo spreminjali oziroma vpeljevali po eno do dve spremenljivki hkrati. Preverili smo vpliv: i) temperature in časa izražanja, ii) liznega pufra, iii) metode bakterijske lize, a nobena od naštetih spremenljivk ni povečala topnosti proteina. Analiza z NaDS-PAGE je pokazala še prisotnost neznanega proteina velikosti približno 40 kDa, ki je predvidoma bakterijskega izvora. Delo smo nadaljevali s pripravo konstrukta, ki je omogočal izražanje proMpl v periplazemski prostor bakterije, vendar takšna sprememba ni povečala topnosti. Naslednji poskus je slonel na predpostavki, da ima proMpl težnjo k agregaciji v primeru prevelike količine izražanja. S tem namenom smo opazovali vpliv koncentracije induktorja in vrste bakterijskega gojišča, kar prav tako ni bila rešitev. Naslovili smo tudi možnost, da se proMpl ne uspe zviti do nativne konformacije. Pripravili smo konstrukt, ki omogoča izražanje nativnega proMpl brez dodatnih aminokislinskih ostankov. Novo pripravljen konstrukt smo izražali v prisotnosti in odsotnosti cinka dodanega v bakterijsko gojišče. Cinkov atom se nahaja v aktivnem mestu proMpl, prav zato bi lahko imel vlogo pri pravilnem zvitju. Poskusili smo še z izolacijo proMpl iz periplazemskega prostora, pri čemer celic nismo lizirali, ampak izvedli metodo modificiranega osmotskega šoka, vendar to ni povečalo topnosti Mpl. Pokazali smo, da rekombinantno izražanje proMpl zahteva posebne pogoje, ki jih kljub sistematskemu iskanju nismo odkrili. V modelu tridimenzionalne strukture, napovedane z AlphaFold2, lahko opazimo nestrukturirane dele in sklepamo na pomembnost propeptida. Predpostavljamo, da bi s sistematično pripravo različnih konstruktov proMpl na osnovi AlphaFold2 modela lahko pripravili take, ki bi se uspešno izražali v E.coli.20222022-09-08 07:55:00Magistrsko delo/naloga139849sl