Optimizacija procesa čiščenja rekombinantnih adeno-asociacijskih virusov na monolitnih nosilcih.Bažec, Kaja (Avtor) Narat, Mojca (Mentor) Tajnik Sbaizero, Mojca (Komentor) rAAVgenska terapijamonolitCIMionsko-izmenjevalna kromatografijaTFFbiotehnologijaZaključni procesi čiščenja rekombinantnih adeno-asociacijskih virusov (rAAV) z uporabo monolitov vsebujejo korake čiščenja, ki so medsebojno odvisni. Za dosego ustreznega rezultata mora biti vsak korak maksimalno optimiziran. Priprava virusne žetve pred kromatografijo zmanjša nečistote in s tem poveča dinamično vezavno kapaciteto na monolitu. Žetev rAAV2/9 iz celic Sf9 smo predhodno pripravili na tri različne načine – acidifikacija, filtracija s tangencialnim tokom (TFF) in TFF v kombinaciji s kriptonazo. Vzorci so bili nato procesirani na kromatografskem koraku zajetja, ki je eden od ključnih korakov v zaključnih procesih čiščenja rAAV. Optimizacija koraka zajetja vodi do povečane produktivnosti zaradi višje dinamične vezavne kapacitete (DVK), večje čistosti produkta in izboljša poznejši korak finega čiščenja rAAV. S CIM® SO3 0,05 mL monolitnimi ploščami s 96 vdolbinicami smo naredili presejalne teste za izbiro optimalne mobilne faze za korak zajetja. Testirali smo pufre z različnimi pH, različnimi koncentracijami natrijevega klorida in poloksamera 188. Z uporabo diska CIMmic® SO3 0,1 mL smo določili pripravo vzorca, ki nam je dala najvišjo eksperimentalno definirano DVK. Pod izbranimi pogoji je ta priprava bila TFF z uporabo kriptonaze (1,44E14 vektorskih kapsid/mL monolita SO3). Rezultati, ki smo jih dobili z eksperimenti na CIM® plošči s 96 vdolbinicami in CIMmic␢ disku, so bili preverjeni tudi na preparativni liniji CIMmultus␢. Elucijska frakcija, ki smo jo dobili na CIMmultus␢ liniji je bila analizirana z metodo BCA in PicoGreen za določitev vsebnosti celokupnih proteinov in dsDNA. Visok vektorski izkoristek in zmanjšanje nečistoč je bilo ugotovljeno za izbrane parametre koraka zajetja, kar potrjuje uspešno optimizacijo koraka zajetja med procesi čiščenja rAAV z monolitnimi nosilci.20222022-09-08 07:15:02Magistrsko delo/naloga139834sl