Izražanje in izolacija skrajšanih oblik človeškega proteina FHL2Šegota, Luka (Avtor) Gaber, Aljaž (Mentor) FHL2β-kateninproteinska interakcijaFHL2 (angl. Four and a half LIM domain protein 2) je adapterski protein, ki je sestavljen le iz štirih in pol domen LIM. Ta je poimenovana po treh genih, pri katerih je bila domena prvič opisana (LIN-11, Isl-1 in MEC-3). Sestavljena je iz dveh zaporednih cinkovih prstov, ki vsak koordinirata vezavo enega Zn2+ iona. Domene LIM nimajo katalitske aktivnosti, vendar se povezujejo z mnogimi proteini, kot so strukturni proteini, receptorji, signalni proteini in transkripcijski partnerji. Zaradi tako širokega nabora vezavnih partnerjev ni čudno, da so proteini, ki vsebujejo domeno LIM, povezani z mnogimi bolezenski stanji. FHL2 sodeluje v mnogih signalnih poteh, med drugim je koaktivator poti Wnt, ki regulira številne celične procese. Glavni mediator te signalne poti je protein β-katenin, ki v tem primeru interagira s FHL2, a je mehanizem te interakcije slabo poznan. V okviru diplomskega dela smo želeli bolje spoznati vlogo posameznih domen FHL2 pri interakcijah s proteini, zato smo načrtali knjižnico 14-ih skrajšanih oblik, ki vsebujejo le eno (LIM0, LIM1, LIM2, LIM3, LIM4), dve (LIM0-1, LIM1-2, LIM2-3, LIM3-4), tri (LIM0-2, LIM1-3, LIM2-4) ali štiri domene (LIM0-3, LIM1-4). Zapise za proteine smo sestavili z metodo PCR, na N-konec pa smo jim dodali heksahistidinsko oznako (His6) in zeleni fluorescenčni protein (sfGFP), ki ju je mogoče odcepiti s proteazo TEV. Zapise smo vključili v tarčni vektor pET-32b(+) in jih izrazili v bakterijskih celicah E. coli. V nadaljevanju smo izrazili in očistili pet proteinov, ki vsebujejo le po eno domeno proteina, pri čemer je bil postopek izražanja in čiščenja enak že prej optimiziranemu protokolu pridobivanja celotnega FHL2. Morebitno interakcijo med posameznimi domenami in β-kateninom smo analizirali z gelsko izključitveno kromatografijo, sklopljeno z detektorjem za analizo statičnega sipanja laserske svetlobe pri majhnem in pravem kotu (LALS/RALS). Tako zastavljena knjižnica konstruktov bo omogočala vpogled v vlogo domen pri interakciji z ostalimi vezavnimi partnerji, kar bo prispevalo k razumevanju mehanizma delovanja FHL2 v bioloških procesih. Postopek čiščenja celotnega proteina se je izkazal za optimalnega tudi pri pridobivanju posameznih domen proteina, a kljub temu so se domene na določene korake čiščenja odzvale različno. Z analizo vezave smo potrdili, da nobena izmed petih domen FHL2 ni dovolj za stabilno reakcijo z β-kateninom, vendar bi za boljši vpogled morali preveriti še interakcijo z ostalimi proteini, ki vsebujejo več domen.20222022-09-07 14:35:00Diplomsko delo/naloga139822sl