Karakterizacija potenciala hidrofobnega žepa EpCAM za vezavo lipidom podobnih molekulTomsič, Nika (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) EpCAMhidrofobni žepDAUDApalmitattirozinska fluorescencaEpCAM je označevalec tumorskih in matičnih celic, ki sodeluje pri signaliziranju preko regulirane intramembranske proteolitične cepitve. V kristalni strukturi zunajceličnega dela EpCAM je bil opažen hidrofoben žep z vezanim kristalizacijskim aditivom N-decil-β-D-maltopiranozid. Struktura bi lahko predstavljala vezavno mesto za fiziološki hidrofoben ligand s podobnimi kemijskimi lastnostmi, to je daljšo hidrofobno verigo. Predhodne raziskave in silico so pokazale, da bi to lahko bila veriga palmitata. Namen našega dela je bil raziskati vezavo hidrofobnega liganda in vitro, pri tem pa smo kot testni ligand izbrali 11-(danzilamino)undekanojsko kislino (DAUDA). Po izražanju in čiščenju proteina v nemutirani in mutirani obliki (zaprt žep) z nikljevo kromatografijo in gelsko filtracijo smo izvedli teste vezave preko merjenja fluorescence DAUDA in merjenjem sprememb intrinzižne tirozinske fluorescence EpEX. Prvi sklop poskusov kaže, da se DAUDA šibko veže na protein ter da jo palmitat izpodrine. Rezultati tudi kažejo, da je vezava DAUDA neodvisna od oligomernega stanja EpEX. Vezave pri mutirani obliki EpCAM v nobenem primeru nismo zaznali oz. je bistveno šibkejša kot pri divjem tipu, kar kaže na to, da do vezave prihaja dejansko v hidrofobnem žepu ali njegovi neposredni okolici. Pri meritvah tirozinske fluorescence smo sicer ob vezavi palmitata opazili spremembo v absorpcijskem spektru, a je ne moremo nedvoumno pripisati vezavi tega liganda. Rezultati so dobra osnova za nadaljnje eksperimente, ki bi eventuelno lahko vodili do identifikacije fiziološko relevantnega liganda EpCAM.20222022-09-07 14:20:00Diplomsko delo/naloga139818sl