Izboljšava sistema za preurejanje genoma na osnovi CRISPR z uporabo obvitih vijačnicBohinc, Jure (Avtor) Forstneric, Vida (Mentor) Murovec, Jana (Komentor) CRISPRPreurejanje genomaUrejevalci primeSistem prime urejanja (PE) je strategija genomskega preurejana, pri kateri je mogoče brez dvojnoverižnih prelomov uvesti poljubno točkovno mutacijo na tarčno mesto v DNA. Temelji na fuziji nikaze Cas9 ter reverzne transkriptaze, povezanih preko peptidnega povezovalca. V tej nalogi predstavimo prilagojen sistem prime urejanja , ki zaobide potrebo po kovalentni povezavi posameznih proteinskih podenot. V nalogi pokažemo, da je posamezne proteine sistema ccPE možno pridobiti z rekombinantnim izražanjem v E. coli in da jih lahko do neke mere očistimo z uporabo gravitacijske Ni-NTA IMAC kromatografije ter gelske izključevalne FPLC kromatografije. S transfekcijo celic HEK293 s plazmidno obliko prilagojenega sistema prime urejanja in poročevalskim plazmidom pokažemo, da je uspešnost preurejanja na izbranem lokusu nekoliko višja od osnovnega sistema PE. Pri transfekciji celic HEK293 z ribonukleoproteinsko obliko prime edit sistema in poročevalskim plazmidom sistem ni kazal uspešnega preurejanja. V prihodnosti bi bilo potrebno optimizirati količine proteinskih in RNA komponent sistema za vnos v celice.20222022-09-04 07:15:57Magistrsko delo/naloga139535sl