Pomen določanja zunajceličnih veziklov za napovedovanje kemorezistence pri seroznem karcinomu jajčnikov visoke stopnje malignostiKelhar, Nuša (Avtor) Černe, Katarina (Mentor) Kobal, Borut (Komentor) rak jajčnikovzunajcelični vezikliEpCAManaliza sledenja nanodelcevnano pretočna citometrijaSerozni karcinom jajčnikov visoke stopnje malignosti (angl. high-grade serous ovarian carcinoma, HGSOC), glavni histološki podtip raka jajčnikov, je vodilni vzrok za smrt med ginekološkimi raki. Poleg poznega odkrivanja bolezni je glavni razlog za slabo prognozo kemorezistenca, hkrati pa ni na razpolago prediktivnega oz. napovednega biomarkerja za razvoj kemorezistence. Zunajcelični vezikli (ZV), ki jih izločajo celice, so prisotni v vseh telesnih tekočinah in omogočajo, v primerjavi z biopsijo, odvzem vzorca ob diagnozi, med zdravljenjem in po končanem zdravljenju. Molekule, ki jih nosijo ZV, naj bi odražale molekule iz celic, iz katerih izhajajo. Molekula EpCAM je povezana z epitelijskimi raki, kakšen je tudi HGSOC. Namen magistrskega dela je bil ugotoviti, ali ima koncentracija celokupnih ZV in EpCAM pozitivnih ZV potencial za napoved kemorezistence. Ker so velikosti ZV v nanometrskem območju, je njihova detekcija otežena, prav tako pa je zahtevna tudi njihova izolacija. Posledično je bil namen tudi optimizacija protokola za določanje ZV v kliničnih vzorcih. V raziskavo smo vključili tri človeške celične linije raka jajčnikov seroznega tipa: OAW28 (izolirana iz klinično potrjeno kemorezistentne bolnice s HGSOC), PEO1 (izolirana iz bolnice z napredovalim stadijem HGSOC in občutljive na zdravljenje s kemoterapijo) in OAW42 (izolirana iz bolnice z začetnim stadijem raka jajčnikov seroznega tipa in občutljive na zdravljenje s kemoterapijo). Poleg tega smo v raziskavo vključili vzorce ascitesa in plazme 12 bolnic z napredovalim stadijem HGSOC. Koncentracijo ZV smo določali z nano pretočno citometrijo (angl. nanoscale flow cytometry, NFC) in z analizo sledenja nanodelcem (angl. nanoparticle tracking analysis, NTA). Pri kliničnih vzorcih smo uporabili različne načine izolacije ZV. Pri PEO1 smo v primerjavi z ostalima dvema celičnima linijama določili najvišjo koncentracijo ZV (p < 0,001). Med koncentracijama ZV pri OAW28 in OAW42 ni bilo statistično značilne razlike (p > 0,05). Izražanje EpCAM je bilo na membrani OAW28 večje kot pri PEO1 (p < 0,01) in OAW42 (p < 0,001). Najvišjo koncentracijo in delež EpCAM pozitivnih ZV smo določili pri OAW28. Delež EpCAM pozitivnih ZV je bil pri OAW28 (45,01 %) višji kot pri PEO1 (10,0 %; p < 0,001) in OAW42 (3,7 %; p < 0,001). Koncentracije EpCAM pozitivnih ZV so bile pozitivno povezane z izražanjem EpCAM na celicah iz katerih ZV izvirajo (r = 0,99; p = 0,02). Z obema metodama detekcije smo ugotovili veliko raznolikost glede koncentracije ZV v kliničnih vzorcih. V ascitesu smo z NTA določili večjo povprečno velikost nanodelcev kot v plazmi (ascites: 130 ± 10,23 nm; plazma 70 ± 3,84 nm; p = 0,028). Med uporabljenimi izolacijskimi metodami smo z obema metodama detekcije določili največjo koncentracijo ZV pri izolaciji s filtracijo in najmanjšo pri izolaciji z ultracentrifugiranjem. Pri izolaciji s kromatografijo z ločevanjem po velikosti (angl. size exclusion chromatography, SEC) se je velikostna porazdelitev nanodelcev v plazmi povečala (p < 0,05). Z NFC smo določili manjšo koncentracijo kot pri NTA, vendar je bila med rezultati obeh metod prisotna pozitivna korelacija ( r = 0,85; p < 0,001). Z našo raziskavo smo ugotovili večjo koncentracijo in delež EpCAM pozitivnih ZV pri celični liniji, izolirani iz klinično potrjene kemorezistentne bolnice s HGSOC, medtem ko koncentracija celokupnih ZV ni bila večja. Obenem je koncentracija EpCAM pozitivnih ZV odražala izražanje EpCAM na membrani celic iz katerih so ZV izhajali. To je prva raziskava, ki dokazuje, da so EpCAM pozitivni ZV, ne pa tudi celokupni ZV, obetajoč prediktivni biomarker za napoved kemorezistence pri HGSOC. Na kliničnih vzorcih ascitesa smo ugotovili, da je možna direktna detekcija ZV z NFC na vzorcih, ki smo jih samo filtrirali. Ta ugotovitev je pomembna za kliniko, kjer mora biti analiza hitra in enostavna. Način izolacije in detekcije ZV močno vpliva na koncentracijo ZV, zato bi morali protokol za klinično določanje ZV dodatno optimizirati preden bi nadaljevali raziskave glede potenciala EpCAM pozitivnih ZV kot prediktivnega biomarkerja za napoved kemorezistence pri HGSOC.20222022-08-26 12:05:00Magistrsko delo/naloga138978sl