Izražanje proteina M33-mCherry v celični liniji HEK293 Flp-In z vstavljenim genom za MLKLJunger, Greta (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) M33 nanotelomCherrykromoteloMLKLFlp-InKinazi podoben protein mešanega rodu, krajše MLKL, je protein s pomembno vlogo pri nekroptozi, vrsti programirane celične smrti z morfološkimi značilnostmi nekroze. Pri nekroptozi sodeluje tako, da tvori oligomer, ki se vgradi v membrano in s tem povzroči celično smrt. Veliko je že znanega o samem poteku in vlogi MLKL proteina pri nekroptozi, nekoliko manj pa o dejanski strukturi oligomera, ki pri tem sodeluje. Za sledenje proteinu MLKL je bil že pripravljen konstrukt M33-mCherry. M33 je nanotelo, ki je specifično za N-konec človeškega MLKL, mCherry pa je fluorescenčni protein. Skupaj tvorita kromotelo. V okviru diplomske naloge smo pogledali, koliko časa po transfekciji s pcDNA3.1-M33-mCherry pride do največjega izražanja kromotelesa M33-mCherry. Transficirali smo celice HEK293 Flp-In, ki imajo v svojem genomu stabilno vstavljen inducibilen zapis za MLKL. Izražanja proteina MLKL nismo inducirali. V različnih časovnih razmakih po transfekciji smo celice lizirali in dobljene lizate analizirali s poliakrilamidno gelsko elektroforezo ob prisotnosti NaDS ter s prenosom western. Po 16 h in 48 h smo celice analizirali tudi s fluorescenčnim mikroskopom, s čemer smo preverili, če in kje v celici se fuzijski protein izraža. Ugotovili smo, da je bila uspešnost izvedene transfekcije nizka, da pa se je protein tam, kjer je bil prisoten, večinoma lokaliziral le v delu celice. Izraženost M33-mCherry se v prvih 24 h ni bistveno spremenila, opazno pa je bilo povečanje po 48 h. Glede na rezultate prenosa western smo sklepali, da je prišlo do delne razgradnje fuzijskega proteina M33-mCherry. Ker transfekcija v našem primeru ni bila najuspešnejša, in ker delamo s celicami Flp-In, ki imajo možnost stabilne vstavitve poljubnega gena v celični genom, bi lahko v nadaljevanju v celice poleg zapisa za MLKL stabilno vstavili še zapis za M33-mCherry, kar bi olajšalo nadaljnje eksperimente.20222022-07-07 14:20:00Diplomsko delo/naloga137999sl