Vanadijevi(V) okso kompleksi s salanom in njihova sposobnost cepitve DNAZorman, Maša (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Sissi, Claudia (Komentor) kemoterapijakemoterapevtikivanadij(V) okso kompleksivanadijevi kompleksi s salanomRak je ena izmed vodilnih bolezni, ki prispevajo k prezgodnji smrti. Samo v letu 2020 je zaradi raka umrlo skoraj 10 milijonov ljudi. Med različnimi načini zdravljenja raka še vedno prevladujeta kemoterapija in radioterapija. Cilj kemoterapije je ustavitev rasti in razmnoževanja tumorskih celic, kar je mogoče zaradi interakcij kemoterapevtikov z različnimi makromolekularnimi tarčami in poseganjem v kritične celične funkcije, kot sta npr. sinteza proteinov in replikacija DNA. Glavni problem kemoterapevtikov je obilica neželenih učinkov kot posledica njihovega delovanja. Odkritje cisplatina v 60-ih letih preteklega stoletja predstavlja velik mejnik v zgodovini kemoterapevtikov na osnovi kovin in je razlog, da se še vedno vlaga v raziskovanje kovinskih kompleksov kot potencialnih terapevtskih sredstev. Kljub široki uporabi cisplatina in njegovih derivatov kot kemoterapevtikov so z uporabo Pt(II)-kompleksov povezane številne omejitve. Različne vrste toksičnosti, izredno močni neželeni učinki in razvoj odpornosti proti zdravilni učinkovini so spodbudili raziskave in razvoj na področju pacientu prijaznejših protirakavih terapij. Različne vanadijeve spojine dokazano motijo biološke funkcije številnih celičnih tarč in obetajo kot potencialne protirakave učinkovine. V nedavni raziskavi vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom so dokazali primerljivo, pogosto tudi višjo, aktivnost kompleksov pri zaviranju tumorskih celic v primerjavi s cisplatinom. Zaradi obetavnosti vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom kot potencialnih protirakavih sredstev smo se v magistrskem delu odločili sintetizirati vrsto kompleksov ter raziskati njihovo stabilnost in sposobnost cepitve DNA. V magistrski nalogi smo pripravili pet različnih vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom in testirali njihovo aktivnost v in vitro-testu s plazmidom pBR322. Pri biološkem testiranju smo komplekse inkubirali s plazmidom in opazovali vpliv naraščajoče koncentracije kompleksov na njihovo sposobnost cepitve DNA. Agarozna gelska elektroforeza je omogočila ločitev nadzvite oblike DNA od cepljene oblike (tj. z zarezo v eni od komplementarnih verig), na podlagi česar smo lahko izvedli kvantifikacijo cepljene DNA pri različnih koncentracijah kompleksa. Opazili smo, da s povišanjem koncentracije kompleksa v inkubacijski mešanici ni signifikantnega porasta v količini cepljene DNA. Zato smo se odločili, da preučimo, kaj se dogaja v inkubacijski mešanici. S kombinacijo analiznih tehnik, kot so jedrska magnetna resonanca, masna spektrometrija in UV-Vis-spektrometrija, smo raziskali stabilnost kompleksov v inkubacijskih pogojih. Opazili smo, da so kompleksi podvrženi hitri disociaciji v eksperimentalnih pogojih med inkubacijo s pBR322. Z izvedbo kinetičnih študij in titracij kompleksov v različnih razmerjih dimetilsulfoksida in fosfatnega pufra smo potrdili, da prisotnost vode v inkubacijski mešanici privede do dekompleksacije. Masna spektrometrija je omogočila, da smo potrdili identiteto novonastalih spojin. Izkazalo se je, da voda privede do hidrolize kompleksa, zato masni spektri vzorcev, ki so vsebovali vodo, prikazujejo dominanten vrh pri m/z (razmerje med maso in nabojem), ki ustreza m/z prostega liganda. Kompleksi ostanejo stabilni samo v čistem dimetilsulfoksidu, kjer nismo opazil nikakršne spremembe UV-Vis-spektra in 51V-NMR-spektra po inkubaciji, masni spekter pa vsebuje poglavitni vrh, ki se ujema z m/z kompleksa. Želeli smo preizkusiti tudi vpliv zamenjave topila na stabilnost kompleksov. Ugotovili smo, da so kompleksi prav tako nestabilni v čistem acetonitrilu in mešanici acetonitrila z vodo. Produkt nestabilnosti, ki nastane v primeru inkubacije kompleksa v acetonitrilu, je sodeč po UV-Vis-spektru najverjetneje drugačen od liganda, ki nastane zaradi hidrolize kompleksa v mešanici dimetilsulfoksida in vode. Verjetno v acetonitrilu poteče bodisi oksidacija kompleksa bodisi dimerizacija kompleksa, žal pa zaradi tehničnih težav ni bilo mogoče izvesti analize z masno spektrometrijo. Preizkusili smo tudi analogni pentakoordinirani vanadijev(V) okso kompleks in ugotovili, da je nestabilen v kakršnikoli mešanici dimetilsulfoksida in pufra, vendar popolnoma stabilen v acetonitrilu in acetonitrilu z dodano vodo. Izvedba agarozne gelske elektroforeze z novim kompleksom pa je žal potrdila, da tudi tu ni nikakršne povezave med koncentracijo kompleksa in sposobnostjo cepitve DNA. Ker so kompleksi občutljivi na vodo, smo se odločili poskusiti vgraditi določene komplekse v micele, ki bi komplekse lahko zaščitili pred vodnim okoljem in preprečili njihovo hidrolizo ter omogočili podaljšano delovanje kompleksov. Vgradnja pentakoordiniranega kompleksa v tri različne vrste micelov je bila uspešna, kljub temu pa inkubacija s plazmidom in agarozna gelska elektroforeza nista razkrili nič obetavnega. Problem je najverjetneje nezmožnost kompleksov, da se sprostijo iz micelov in so zato popolnoma neaktivni. Nazadnje smo se odločili izvesti še titracijo kompleksov s telečjo timusno DNA, s čimer smo potrdili, da prihaja do interakcij med DNA in kompleksi, le da interakcija verjetno ne vodi v cepitev DNA, temveč verjetno lahko citotoksičnost pripišemo drugačnemu mehanizmu delovanja. Najverjetneje prihaja do vezave kompleksov na DNA, kar bi lahko potencialno vodilo v zaustavitev esencialnih celičnih mehanizmov, kot so npr. podvojevane DNA in prepisovanje iz DNA v mRNA. Izračunali smo tudi navidezno konstanto disociacije za interakcije med DNA in posameznim kompleksom. Vrednosti konstante disociacije so bile v razponu med 3 μM in 30 μM, kar ne nakazuje na pretirano močno interakcijo med DNA in kompleksi, lahko pa vendarle vsaj deloma pojasni citotoksičnost, ki so jo opazili v predhodnih študijah na tumornih celičnih linijah. To delo je omogočilo majhen vpogled v aktivnost in mehanizem vanadijevih(V) okso kompleksov s salanom. Zagotovo kompleksi interagirajo z DNA in se nanjo vežejo, kar lahko pojasni opažanja predhodnih raziskav. Nikakor pa ne moremo izključiti možnosti, da kompleksi delujejo še na kakšno drugo celično tarčo. Preden lahko z gotovostjo trdimo, kakšen je mehanizem delovanja kompleksov, pa so zagotovo potrebne nadaljnje raziskave.20212022-07-04 20:06:19Magistrsko delo/naloga137870sl