Načrtovanje, sinteza in vrednotenje radiooznačenih ligandov za somatostatinske in holecistokininski-2 receptorKrošelj, Marko (Avtor) Gmeiner, Tanja (Mentor) Mlinarič-Raščan, Irena (Komentor) Gaberšček, Simona (Član komisije) nevroendokrini tumorjimedularni tumorjizdravljenjenuklearna medicinaradiofarmacijaradiooznačeni peptidiholecistokininski receptorjisomatostatinski receptorjiradiooznačevanjeradionuklidiminigastrinsomatostatinanalogifarmakokinetikaMedularni rak ščitnice (ang. Medullary Thyroid Cancer, MTC) predstavlja okoli 3,5 % vseh rakov ščitnice in se uvršča med redke bolezni. MTC je nevroendokrini tumor, ki v nasprotju z ostalimi vrstami raka ščitnice ne izhaja iz folikularnih celic ščitnice, njegove metastaze pa ne kopičijo radioaktivnega jodida. Zato je obravnava bolnikov z medularnim rakom ščitnice bolj zahtevna. Ob postavitvi diagnoze je pri večini bolnikov bolezen že napredovala, saj MTC ponavadi metastazira že pred pojavom simptomov. Trenutni pristopi zdravljenja (agresivno kirurško zdravljenje, kemoterapija, novejši zaviralci tirozin kinaz) so le deloma učinkoviti in so povezani s pojavom neželenih učinkov. Iskanje učinkovitega zdravljenja bolnikov z napredovalim MTC ostaja danes še vedno izziv za mnoge raziskovalne skupine. Nuklearna medicina ima v obravnavi onkoloških bolnikov pomembno vlogo tako pri diagnostiki kot tudi pri zdravljenju. Radiooznačeni peptidi predstavljajo pomemben razred radiofarmakov za diagnostiko in zdravljenje tumorjev, ki imajo na celični površini prekomerno izražene receptorje za regulatorne peptide. Ti peptidi imajo visoko afiniteto in specifičnost do receptorjev. Odkritje, da so pri medularnem raku ščitnice (ter še nekaterih ostalih rakih) prekomerno izraženi receptorji za holecistokininski receptor 2 (CCK2R), je omogočilo razvoj radiooznačenih analogov minigastrina za slikovno diagnostiko ter ciljano radionuklidno terapijo. Hkratna ekspresija somatostatinskih receptorjev in CCK2R pri MTC in drugih tipih rakov pa omogoča uporabo radiooznačenih analogov somatostatina pri obravnavi bolnikov z MTC ter tudi načrtovanje in razvoj t.i. hibridnih molekul za ciljanje multireceptorskih tarč. Glavni namen doktorske disertacije je bil načrtovanje, sinteza, radiooznačevanje in ovrednotenje novih analogov minigastrina in somatostatina z namenom optimizacije radiofarmacevtskih ter farmakokinetičnih lastnosti. Uspešno radiooznačevanje načrtovanih peptidov z različnimi radionuklidi (indij-111, galij-68, lutecij-177, itrij-90, bizmut-213) ter njihovo ustrezno ovrednotenje omogoča tudi translacijo (prenos) novih dognanj v klinično prakso. Raziskave smo tako zasnovali v več sklopih in jih načrtovali tako, da bomo lahko izsledke doktorske disertacije tudi implementirali v klinično prakso pri rutinski pripravi radiofarmakov in obravnavi bolnikov. Osnova za načrtovanje ter razvoj novih radiooznačenih analogov minigastrina v doktorskem delu so bili tudi izsledki raziskav, opisani v poglavju 1. Pri ciljani radionuklidni terapiji s peptidnimi radiofarmaki je največja težava nefrotoksičnost, saj se peptidne učinkovine večinoma izločajo skozi ledvice, kjer se tudi deloma ponovno privzamejo. Visoko zadrževanje radiooznačenih analogov minigastrina v ledvicah lahko zmanjšamo s sočasnim injiciranjem poliglutaminskih kislin, gelofuzina, albumina ali albuminskih fragmentov. Glavni mehanizem zadrževanja minigastrinskih analogov v ledvicah so povezovali z N-terminalnimi glutaminskimi kislinami (torej celokupnim nabojem molekule). S primerjavo dveh analogov, ki se razlikujeta le v stereokemiji aminokislin v distančniku (L- in D-Glu), ne pa tudi v kemijski sestavi in naboju, smo ugotovili velike razlike v metabolični stabilnosti ter v privzemu in zadrževanju v ledvicah. Pokazali smo tudi pomembno vlogo sekundarne strukture peptidnih molekul na farmakokinetične lastnosti. V prvem sklopu doktorskega dela smo sintetizirali ter ovrednotili več novih, z indijem-111 (111In) radiooznačenih analogov minigastrina. Z uporabo analogov z različnimi distančniki med bifunkcionalnem kelatorjem ter C-terminalnim delom minigastrina, ki je odgovoren za vezavo na receptor, smo sintetizirali novo serijo analogov minigastrina. Analogi s t.i. mešanim distančnikom (izmenjajoče nenaravne aminokisline s kislimi ali bazičnimi funkcionalnimi skupinami v stranski verigi ali brez njih; (D-Gln-D-Glu)3 in (D-Gln-D-Asp)3) v primerjavi z analogom, ki imajo v distančniku samo neionske (6 D-Gln) aminokisline, izkazujejo nižjo metabolično stabilnost, v primerjavi z analogom z ionskim distančnikom (6 D-Glu) pa podobno metabolično stabilnost. Vsi novi analogi imajo podobno vezavno afiniteto do CCK2R v nM območju. Metionin v C-terminalnem delu minigastrinskih analogov se pri radiooznačevanju pri povišani temperaturi oksidira in s tem izgubi vezavno afiniteto do CCK2R, kar smo pokazali tudi s študijo na živalskem modelu in vivo. Z izosterno zamenjavo z norlevcinom se tej težavi enostavno izognemo. Ker literaturni podatki kažejo nasprotujoče si rezultate pri študijah analogov z norlevcinom in vitro, smo s primerjavo rezultatov raziskav in vitro ter in vivo pokazali, da menjava bistveno ne vpliva na vezavno afiniteto do CCK2R, metabolično stabilnost ter biodistribucijo na živalskih modelih. Pokazali smo, da se ti analogi hitro nakopičijo v tumorju ter se tam zadržijo tudi 4h po injiciranju. Dolgo zadrževanje radiooznačenih peptidov je predpogoj za njihovo uporabo v ciljani radionuklidni terapiji s peptidnimi radiofarmaki (ang. Peptide Receptor Radionuclide Therapy, PRRT). Glavne prednosti peptidnih analogov z norlevcinom so lažja formulacija peptida za radiooznačevanje, izboljšana radiokemijska čistota ter odsotnost stranskih produktov pri radiooznačevanju, kar v našem primeru pomeni varnejša in učinkovitejša zdravila - radiofarmake. Uporaba peptidnih analogov, radiooznačenih z različnimi radionuklidi (diagnostičnimi, kot sta 111In in 68Ga, in terapevtskimi, kot so 177Lu, 90Y, 213Bi), omogoča t.i. teranostični pristop k obravnavi bolnikov. 68Ga je eden redkih PET (ang. Positron Emission Tomography) radionuklidov, ki za pridobivanje ne potrebuje ciklotrona. Rokovanje z visokoenergijskimi PET ali β- sevalci je kritično z vidika varstva pred ionizirajočem sevanjem, zato je v vsakdanji klinični in tudi raziskovalni praksi zelo pomembna avtomatizacija procesov. V drugem sklopu raziskav smo z uporabo modularnega sistema za popolnoma avtomatizirano pripravo radiofarmakov razvili metode za radiooznačevanje klinično pomembnih analogov somatostatina za diagnostiko (68Ga-DOTATATE) ter PRRT (90Y-, 177Lu-DOTATATE). Uspešno smo razvili metodo za avtomatizirano radiooznačevanje dveh minigastrinskih analogov z 68Ga ter izračunali zaščitne faktorje pred radioaktivnim sevanjem. Izbrane minigastrinske analoge smo uspešno radiooznačili z 213Bi ter primerjali lastnosti in vitro z 111In radiooznačenimi analogi. Primerjava je pokazala, da menjava kovinskega radionuklida ne vpliva na lastnosti in vitro in bi te analoge lahko uporabili v ciljani terapiji z delci alfa. Ker MTC sočasno izraža več različnih receptorjev smo z vidika multireceptorskega pristopa k obravnavi MTC optimizirali tako analoge minigastrina kot somatostatina. Razvili smo nove analoge minigastrina z izboljšanimi lastnostmi ter razvili metode radiooznačevanja za nove analoge minigastrina ter nekatere že klinično uveljavljene analoge somatostatina. Na ta način smo postavili osnovo za uporabo teh radiooznačenih peptidov v multireceptorskem pristopu k prikazovanju ali ciljani terapiji MTC. Načrtovali smo tudi t.i. »hibridno« molekulo, ki bi združevala minigastrinski ter somatostatinski del in bi omogočala tudi radiooznačevanje. Uspešno smo sintetizirali združen minigastrinski ter somatostatinski del, neuspešni pa smo bili pri konjugaciji te molekule z bifunkcionalnim kelatorjem, ki bi omogočil tudi radiooznačevanje ter nadaljnjo ovrednotenje s študijami in vitro ter in vivo. V zadnjem delu opisujemo pomembnost merjenja radioaktivnosti z radionuklidnim kalibratorjem pred aplikacijo pripravljenih odmerkov preiskovancem. Posledica napačnih meritev in posledično odmerjanja radiofarmakov je lahko prevelika izpostavljenost preiskovanca ionizirajočem sevanju, v najslabšem primeru tudi toksičnost, po drugi strani pa bi prenizka radioaktivnost za preiskovanca pomenila neustrezno kakovost slikovne diagnostike ali neučinkovito zdravljenje. Na meritev radioaktivnosti vplivajo vrsta radionuklida, vrsta vsebnika (geometrijsko telo), v katerem se radionuklid nahaja, in volumen raztopine v samem vsebniku. Z meritvami 90Y in 111In v različnih radionuklidnih kalibratorjih smo ugotovili, da se lahko izmerjene meritve z uporabo tovarniško določenih kalibracijskih faktorjev od dejanskih razlikujejo tudi za do 25 %. Odstopanja so še posebej kritična pri meritvah radioaktivnosti terapevtskih sevalcev β-, saj je za učinkovito in varno PRRT izjemnega pomena natančno odmerjanje terapevtskih radiofarmakov. [M. Krošelj]20172022-06-16 10:57:26Doktorska disertacija137421sl