Vloga cisteinskih katepsinov B in X in njunih inhibitorjev pri epitelno-mezenhimskem prehodu tumorskih celicMitrović, Ana (Avtor) Kos, Janko (Mentor) cisteinske proteinazekatepsin Bkatepsin Xrak (medicina)patogenezatumorinvazijatumorske celiceepitelno-mezenhimski prehodinhibitorjidisertacijePoveĉano izraţanje in aktivnost lizosomskih cisteinskih karboksipeptidaz, katepsinov B in X, je v telesu povezano s številnimi patološkimi procesi, vkljuĉno z nastankom in napredovanjem raka. Pri slednjem sta katepsina B in X udeleţena pri razgradnji zunajceliĉnega matriksa (ZCM), migraciji, invaziji, metastaziranju in angiogenezi. Pri napredovanju tumorjev ima pomembno vlogo tudi epitelno-mezenhimski prehod (EMT), kjer pa udeleţenost katepsinov B in X ni natanĉno poznana. V okviru doktorske disertacije smo zato v prvem delu raziskali udeleţenost katepsinov B in X pri EMT in razloţili mehanizme njunega delovanja pri tem procesu. Z uporabo tumorskih celiĉnih linij, ki se razlikujejo v izraţanju epitelijskih in mezenhimskih oznaĉevalcev in morfologiji celic, smo pokazali, da so višje koncentracije katepsinov B in X povezane z invazivnim mezenhimskim celiĉnim fenotipom in spodbujajo EMT. Nasprotno lahko obraten proces mezenhimsko-epitelnega prehoda sproţimo z njunim hkratnim utišanjem. Kot moĉnejši promotor EMT se je izmed obeh katepsinov izkazal katepsin B. Na epitelijski celiĉni liniji raka dojke MCF7 smo spremljali tudi spremembe v izraţanju katepsinov B in X po sproţitvi EMT s transformirajoĉim rastnim dejavnikom β1 (TGF-β1), ĉigar signalna pot je ena kljuĉnih signalnih poti, ki sproţi EMT pri raku. TGF-β1 je poveĉal izraţanje in aktivnost katepsina B, izraţanje katepsina X pa ni odvisno od TGF-β1. Dobljeni rezultati tako opredeljujejo EMT kot dodatni mehanizem, preko katerega katepsina B in X prispevata k napredovanju tumorjev. Z zmanjšanem njunega izraţanja ali inhibicijo encimske aktivnosti lahko tako tumorskim celicam povrnemo manj agresiven epitelijski celiĉni fenotip. Katepsina B in X sta zaradi svoje pomembne vloge pri številnih procesih pri raku primerni tarĉi za razvoj novih protitumornih uĉinkovin. V naslednjem sklopu doktorata smo se zato osredotoĉili na identifikacijo novih nizko molekularnih spojin, ki bi selektivno in reverzibilno zavirale aktivnost katepsinov B in X ter bi bile primerni kandidati za nadaljnja testiranja. Katepsin B ima, zaradi prisotnosti dodatnega strukturnega elementa, imenovanega zapora zanka, poleg karboksipeptidazne (eksopeptidazne) aktivnosti, tudi endopeptidazno aktivnost. Ravno za slednjo je veljalo, da je odgovorna za škodljivo delovanje katepsina B pri raku. V nadaljevanju doktorske disertacije smo z uporabo novih selektivnih sinteznih inhibitorjev katepsina B 2-{[(8-hidroksi-5-nitrokinolin-7-il)metil]amino}-acetonitril (1), 8- (4-metilpiperidin-1-il)-5-nitrokinolin (2) in 7-[(4-metilpiperidin-1-il)metil]-5-nitrokinolin-8-ol (3) ovrednotili vpliv obeh aktivnosti katepsina B na razgradnjo ZCM in tumorsko invazijo. Pri tem smo pokazali, da obe aktivnosti katepsina B – tako endopeptidazna kot eksopeptidazna – prispevata k razgradnji ZCM in invaziji tumorskih celic. Inhibitorji, ki bi hkrati moĉno inhibirali obe aktivnosti, bi bili uporabni v protitumorski terapiji. V in vitro in in vivo tumorskih modelih smo ovrednotili protitumorno delovanje nitrokoslina, znane protimikrobne uĉinkovine, ki je bil v predhodni študiji identificiran kot uĉinkovit selektivni inhibitor endopeptidazne aktivnosti katepsina B. Na izbranih tumorskih in endotelijskih celiĉnih linijah, ki izraţajo veĉje koliĉine katepsina B, je nitroksolin znaĉilno zmanjšal zunajceliĉno razgradnjo DQ-kolagena IV, invazijo tumorskih celic, kot tudi rast in invazijo veĉceliĉnih tumorskih sferoidov ter tvorbo endotelijskih cevk v modelu angiogeneze. Prav tako je znaĉilno zmanjšal rast tumorjev, angiogenezo in metastaziranje in vivo v treh neodvisnih mišjih tumorskih modelih. Izsledki raziskave tako opredeljujejo nitroksolin kot obetavno novo zdravilo za zdravljenje raka. V nadaljevanju smo ovrednotili še protitumorno delovanje derivata nitroksolina z 2-(etilamino)acetonitrilnim substituentom na mestu 7 (spojina 17), ki je v predhodni študiji v testih encimske kinetike izkazoval znaĉilno boljšo inhibicijo endopeptidazne aktivnosti katepsina B v primerjavi z nitroksolinom. Spojina 17 je bolj uĉinkovito zmanjšala tudi invazijo tumorskih celic in njihovo migracijo. Hkrati je v primerjavi z nitroksolinom bolj uĉinkovito zmanjšala tudi rast tumorjev in vivo na LPB mišjem modelu fibrosarkoma. Z dodatkom 2-(etilamino)acetonitrilne skupine na molekulo nitroksolina smo tako uspeli izboljšati njegove farmakološke lastnosti in pridobiti novo, še bolj uĉinkovito spojino, ki je kandidat za protitumorno terapijo. V naših raziskavah smo kot uĉinkovit inhibitor katepsina B med drugim identificirali tudi kompleks kliokinola z rutenijem [Ru(η6-p-cimen)(Cq)Cl]. Kompleks kliokinola z rutenijem v nizkih koncentracijah ni vplival na viabilnost celic, je pa znaĉilno zmanjšal razgradnjo proteinov ZCM in invazijo tumorskih celic, ki smo jo spremljali kontinuirano v realnem ĉasu in s spremljanjem rasti veĉceliĉnih tumorskih sferoidov. Izsledki raziskave tako razkrivajo specifiĉen mehanizem protitumornega delovanja kompleksa kliokinola z rutenijem, ki je neodvisen od splošne citotoksiĉnosti spojin. Hkrati kaţejo njegovo moţno uporabo kot spojino vodnico za razvoj novih rutenijevih spojin za terapijo raka. V okviru našega dela smo se osredotoĉili tudi na iskanje novih inhibitorjev katepsina X in preverjanje njihovega protitumornega delovanja. Z rešetanjem interne knjiţnice spojin smo kot reverzibilne in selektivne inhibitorje katepsina X identificirali spojine s triazolno strukturo. Izmed teh je imela najniţjo konstanto inhibicije spojina (1-(2,3-dihidrobenzob1,4dioksin-6-il)-2-((4-izopropil-4H-1,2,4-triazol-3-il)tio)etan-1-on) (Z9), ki je bila tudi veĉ kot stokrat bolj selektivna za katepsin X v primerjavi s sorodnimi katepsini. Spojina Z9 je znaĉilno zmanjšala migracijo tumorskih celic, poleg protitumornega delovanja pa je poveĉala tudi izrašĉanje nevritov na modelih nevrodegenerativnih obolenj. Triazolni inibitorji katepsina X so tako zanimivi kandidati za nadaljnje in vivo študije in hkrati spojine vodnice za razvoj novih inhibitorjev katepsina X. [A. Mitrović]20172022-06-16 10:32:44Doktorska disertacija137418sl