Proučevanje fizikalnih metod in dostavnih sistemov za povečanje dermalnega vnosa učinkovinZorec, Barbara (Avtor) Pavšelj, Nataša (Mentor) Kristl, Julijana (Komentor) dermalni vnos učinkovintransdermalni vnos učinkovinzdravilne učinkovineelektroporacijalaserska mikroablacijaultrazvokKoža kot največji in lahko dostopen človeški organ predstavlja za vnos zdravilnih učinkovin privlačno alternativo drugim načinom vnosa molekul v telo. Ker pa je poglavitna funkcija kože zaščita in obramba telesa pred vplivom zunanjega makro in mikro okolja, je pasivni prehod molekul skozi kožo praktično nemogoč. Za zagotovitev uspešnega vnosa molekul skozi kožo in/ali v celice kože je potrebno skrbno izbrati metodo ali kombinacijo metod pospeševanja dermalnega in transdermalnega vnosa in jo/jih optimizirati za določeno ciljno aplikacijo. Glavni namen in cilj raziskovalnega dela je bil razvoj učinkovite kombinacije metod za pospešitev vnosa molekul skozi in v kožo ter primerjava le-teh. Osredotočila sem se na tri različne fizikalne pristope pospešitve vnosa: i) Elektroporacija: povečanje prehodnosti zunanje rožene plasti kože (stratum corneum), in/ali membran celic v nižjeležečih plasteh kože ob izpostavitvi kožnega tkiva električnim pulzom, zaradi lokalnih sprememb v mikrostrukturi lipidov celičnih membran. Te spremembe so odvisne od amplitude, trajanja in števila pulzov in so lahko velikosti reda nekaj nano do mikrometrov, pa vse tja do večjih lokalnih transportnih področij (LTR – angl.: local transport regions) velikosti nekaj 100 mikrometrov. Pri električno nabitih molekulah lahko z električnimi pulzi dodamo tudi potisno silo; ta pojav imenujemo elektroforeza; ii) Laserska mikroablacija: izpostavitev kože laserskemu žarku z namenom ustvarjanja mikro-kanalčkov v roženi plasti; iii) Ultrazvok: uporaba nizkofrekvenčnega ultrazvoka (20-40 kHz) z namenom ustvarjanja prehodnih poti v roženi plasti kože zaradi kavitacije (sonoporacija), termalnih učinkov in mehanskega potiska (sonoforeza). Optimiziranim protokolom fizikalnih metod pospešitve vnosa smo dodali primerjavo dermalnega vnosa molekul, vgrajenih v nano-dostavne sisteme (liposome in etosome) in tako združili uporabo kombinacij različnih fizikalnih pristopov in dostavnih sistemov. V prvem delu doktorske naloge je delo potekalo in vitro na dermatomirani koži prašičjih ušes v dvoprostornem sistemu t.i. Franz-ovih difuzijskih celic, kjer smo preizkusili uspešnost pospešitve vnosa modelne molekule kalceina z elektroporacijo. Osredotočili smo se na primerjavo različnih kombinacij pravokotnih električnih pulzov, in sicer kratkih visokonapetostnih (angl. high voltage – HV) in dolgih nizkonapetostnih (angl. low voltage – LV) pulzov. Ugotovili smo, da več dolgih LV pulzov bistveno poveča kasnejši pasivni transport kalceina skozi kožo, medtem ko je učinkovitost pospešitve kalceina pri uporabi kratkih HV pulzov zanemarljivo majhna. Dokazali smo tudi, da kratki HV pulzi, ki jim sledijo daljši pulzi, transport molekule preko kože v primerjavi s samo dolgimi LV pulzi, bistveno zmanjšajo. To dokazujemo z rezultati numeričnega modela, ki temelji na razvoju lokalnih transportnih regij (LTR). V nadaljni študiji smo z elektroporatorjem »Green skin pore«, s katerim smo v kožo vnašali barvilo patent blue in le-tega kasneje v histoloških preparatih dokazali z mikroskopijo, da lahko z elektroporacijo zagotovimo enakomeren vnos in porazdelitev molekul predvsem v zgornjih plasteh kože. Metoda elektroporacije je tako primerna za dermalni vnos molekul in za aplikacije pri katerih moramo zagotoviti vnos molekul ne samo v kožno tkivo temveč v notranjost celic. V nadaljevanju smo na enakem eksperimentalnem modelu z lasersko mikroablacijo zgornjih plasti kože s pomočjo laserja Er:YAG primerjali različne dolžine laserskih pulzov pri konstantni ali variabilni energiji in njihovo uspešnost pospešitve transdermalnega vnosa treh različno velikih FITC dekstranov (4 kDa, 10 kDa in 20 kDa). Ugotovili smo, da energija dovedenih pulzov večinoma narekuje velikost/globino lasersko povzročenih mikrokanalčkov, medtem ko dolžina laserskih pulzov narekuje predvsem obseg termično spremenjenega tkiva. Spremembe parametrov laserskih pulzov imajo različne vplive na molekule različnih fizikalno-kemijskih lastnosti, zato je potrebna optimizacija protokolov laserskih pulzov za vsako molekulo in medicinsko aplikacijo posebej. V nadaljni študiji smo prešli na ex vivo model celotne debeline prašičje kože, s čemer smo se bolj približali in vivo pogojem. Razvili in optimizirali smo elektroporacijske (dovajanje enosmernih električnih pulzov) in sonoporacijske (dovajanje nizkofrekvenčnega ultrazvoka) protokole in raziskali uspešnost kombinacij metod za pospeševanje transdermalnega vnosa molekul. Rezultati so pokazali statistično signifikantno povečanje vnosa kalceina v kožo že z uporabo 6x100 kratkih visokonapetostnih električnih pulzov (amplitude 200 V in trajanja 100 μs), ali po 5 minutah izpostavitve nizkofrekvenčnemu ultrazvoku. Kasneje smo z željo, da bi dosegli sinergistični efekt metodi uporabili v kombinaciji, tako da je ena neposredno sledila drugi. Rezultati so nas presenetili, saj vnos molekule pri kombinaciji obeh metod skupaj ni bil večji od vnosa molekule pri vsaki metodi posebej. Mehanizem pospešitve vnosa pri obeh metodah temelji na ustvarjanju novih transportnih poti preko rožene plasti, pri čemer je pri kombinaciji obeh (ne glede na vrstni red) druga metoda neuspešna pri tvorbi dodatnih transportnih poti v koži. Zaradi že obstoječih transportnih poti ustvarjenih s prvo metodo je namreč koža spremenjena do te mere da so začetni pogoji ob uporabi druge metode drugačni in neugodni za nastanek novih transportnih poti. V zadnjem delu doktorske naloge smo poleg razvitih protokolov preverjali uspešnost pospešitve transdermalnega vnosa molekul kalceina, vgrajenih v nano-dostavne sisteme. Liposomi so se izkazali kot uspešni pospeševalci vnosa kalceina v epidermis kože, kjer služijo kot nekakšen rezervoar učinkovine. Po drugi strani so se etosomi izkazali kot izredno uspešni dermalni in transdermalni pospeševalci vnosa, ki lahko dostavijo molekule tudi v nižje predele kože. Z raziskovalnim delom smo s kombinacijo teoretičnega in eksperimentalnega pristopa dodatno osvetlili mehanizme delovanja vseh treh fizikalnih metod pospešitve dermalnega in transdermalnega vnosa posebej in nekaterih njihovih kombinacij. Znanje, pridobljeno na omenjenem področju predstavlja pomemben prispevek k znanosti in bo pripomoglo k nadaljnemu razvoju novih načinov vnosa molekul v telo preko kože.[B. Zorec]20172022-06-16 09:06:15Doktorsko delo/naloga137399sl