Vrednotenje imunske modulacije in učinkovitosti agonista receptorja EP4 in monoklonskih protiteles in vitroMarkovič, Tijana (Avtor) Mlinarič-Raščan, Irena (Mentor) zdravilne učinkovineimunomodulatorno delovanjevrednotenjemetodelimfoblastoidne celične linijereceptor EP4agonistilimfommonoklonska protitelesalevkemija celic BOvrednotenje imunomodulatornih učinkov spojin je pomemben del predkliničnega razvoja zdravil. Razvoj zanesljivih in reprezentativnih metod za ovrednotenje imunomodulatornih učinkov spojin je zato izrednega pomena. V luči novih smernic in zakonodaje Evropske unije »Direktiva 2010/63/EU« za zaščito živali, ki se uporabljajo v raziskovalne namene, se trendi v napovedovanju učinkovitosti in toksičnosti pomikajo od in vivo testiranja na živalih k in silico in in vitro testnim sistemom. Glavni namen doktorske disertacije je doprinesti k razvoju novih imunomodulatornih učinkovin. V ta namen smo raziskave zasnovali v dveh sklopih. V prvem sklopu smo vzpostavili nov in vitro testni sistem za vrednotenje imunomodulatornega delovanja spojin, v drugem sklopu pa smo preučevali delovanje agonistov receptorja EP4 in monoklonskih protiteles v malignih limfocitih B. Predhodne študije naše raziskovalne skupine so identificirale zgodnje spremembe v transkripcijskih mehanizmih, ki razlikujejo med negativno selekcijo in klonalno ekspanzijo limfocitov B. V kompleksnem transkripcijskem programu, ki ga sproži B-celični receptor (BCR), je bil identificiran gen Ptger4, ki kodira receptor EP4 in pomembno vpliva na odločitev o nadaljnjem poteku življenjskega cikla limfocitov B. Prostaglandin E2 (PGE2) je močan regulator funkcije limfocitov B, ki posreduje pro-vnetne in imunoregulatorne učinke. PGE2 je lipidna molekula, ki ima pomembno vlogo v fizioloških in patofizioloških procesih in deluje preko štirih z G-proteinom sklopljenih podtipov receptorjev EP1, EP2, EP3 in EP4. Vsak od teh receptorjev je pomembna terapevtska tarča z lokalizacijami v različnih tkivih in inducira specifične signalne poti, ki smo jih podrobneje povzeli v prvem poglavju. Receptor EP4 je sklopljen s proteinom G-αS, kar vodi v aktivacijo adenilat ciklaze in posledično povišanje znotrajceličnega cikličnega adenozin monofosfata (cAMP). Poleg klasične od cAMP odvisne poti, vodi aktivacija receptorja EP4 tudi v alternativne poti kot je inhibicija signalizacije preko jedrnega transkripcijskega dejavnika NF-κB. Ekspresija receptorja EP4 ni vezana na posamezen organ ali tkiva. Visoko je izražen v maternici, koži, gastrointestinalnem traktu ter v krvotvornih organih. Modulatorji receptorja EP4 tako predstavljajo potencialna zdravila za zdravljenje ulcerativnega kolitisa, trdnih tumorjev, kardiovaskularnih bolezni in B celičnega limfoma (Markovič et. al, 2017). V prvem delu doktorske naloge smo vzpostavili nov in vitro testni sistem za vrednotenje imunomodulatornih lastnosti spojin na osnovi limfoblasotidnih celičnih linij (LCL). Za vrednotenje celic LCL smo izbrali štiri znane imunomodulatorne spojine: tributilkositrov klorid, ciklosporin A, benzo(a)piren in verapamil hidroklorid ter tri imuno-inertne spojine: uretan, furosemid in manitol. In vitro testni sistem temelji na sposobnosti celic, da se odzivajo na imunomodulatorne spojine. Ugotovili smo, da predstavljajo človeške celice LCL zanesljiv in vitro testni sistem za oceno imunomodulatornih lastnosti spojin, ki lahko razlikuje med imunomodulatornimi in imunsko inertnimi spojinami. Hkrati lahko uporaba panela z desetimi limfoblastoidnimi celičnimi linijami, ki izvirajo iz nesorodnih zdravih posameznikov, omogoča vpogled v inter-individualno variabilnost v odzivu na določeno spojino. Celice LCL tako predstavljajo novo alternativno metodo za vrednotenje imunomodulatornih učinkov spojin (Markovič et. al, 2015). V drugem sklopu raziskav smo vrednotili receptor EP4 kot potencialno terapevtsko tarčo za zdravljenje B celičnih levkemij in limfomov, katerih preživetje je odvisno od konstitutivne aktivacije NF-κB. Znano je, da receptor EP4 posreduje zaviralne učinke na rast zrelih in nezrelih limfocitov B preko anti-apoptotičnega transkripcijskega dejavnika NF-κB. Z uporabo farmakološkega pristopa smo dokazali, da receptor EP4 inducira preko kaspaz posredovano apoptozo v maligno transformiranih limfocitih B. Ker je povečana aktivnost NF-κB podlaga za razvoj rezistence na številne spojine, smo modulirali to signalno pot preko aktivacije receptorja EP4. Specifični agonist receptorja EP4, PgE1-OH, je znižal aktivnost NF-κB in posledično raven anti-apoptotičnega gena Bcl-XL v celicah Ramos, kar je vodilo v povišano občutljivost celic na z bortezomibom in doksorubicinom inducirane kemoterapevtske učinke. Specifično znižanje od NF-κB odvisnih poti v B-celičnih malignih boleznih odpira nove možnosti za zdravljenje in optimizacijo sedanje terapije z uporabo specifičnih agonistov receptorja EP4 (Gobec et al, 2014). Nadalje smo raziskali vlogo receptorja EP4 v kronični limfocitni levkemiji (KLL). KLL je najpogostejše hematološko maligno obolenje pri odraslih in velja za trenutno neozdravljivo bolezen. Primarne celice smo izolirali iz polne krvi bolnikov z diagnozo KLL, ki so privolili v sodelovanje v raziskavi (dovoljenje KME št. 93/12/10). S pretočno citometrijo smo dokazali višjo ekspresijo receptorja EP4 pri celicah KLL v primerjavi s celicami LCL, pridobljenimi iz krvi zdravih darovalcev. Ugotovili smo, da so citotoksični učinki PgE1-OH posredovani izključno preko receptorja EP4, saj je imel endogeni ligand PGE2, ki se veže na vse 4 EP receptorje, nizek citotoksičen potencial. V skladu s tem je antagonist receptorja EP4 zavrl s PgE1-OH inducirano apoptozo. Citotoksični učinki agonista receptorja EP4, PgE1-OH, so bili časovno in koncentracijsko odvisni, vrednosti EC50 pa so bile 13.53 μM po 24 h (N=151) in 7.21 μM po 48 h (N= 140). PgE1-OH je izkazal inter-individualno variabilnost, kar je v skladu z dejstvom, da je KLL izredno heterogena bolezen. Agonist receptorja EP4 je deloval selektivno na celice KLL v primerjavi s celicami LCL in perifernimi mononuklearnimi celicami (PBMC), pridobljenimi iz krvi zdravih darovalcev. Poleg tega so bile EC50 vrednosti za PgE1-OH po 24 h nižje v primerjavi z fludarabinom. Posebnega pomena je odkritje, da je agonist receptorja EP4 induciral apoptozo pri celicah bolnikov s KLL, ki so rezistentni na standardno citotoksično terapijo in nosijo delecijo TP53 gena. Poleg tega je PgE1-OH pri celicah KLL deloval sinergistično s fludarabinom, kar bi lahko omogočilo nov terapevtski pristop za zdravljenje KLL. Mikro-okolje v KLL je močna gonilna sila za preživetje malignih limfocitov B in rezistenco na apoptozo, zanj pa je značilna konstitutivna aktivacija BCR in povečana koncentracija citokinov. Agonist receptorja EP4 je posredoval imunonomodulatorne učinke, saj je signifikantno znižal izločanje citokinov IL-2, IL-10, TNFα in IFNγ v primerjavi z netretiranimi celicami LCL. Receptor EP4 smo tako ovrednotili kot obetavno terapevtsko tarčo za zdravljenje KLL. V zadnjem delu doktorske disertacije smo vrednotili delovanje monoklonskih protiteles in agonista receptorja EP4 in vitro. Monoklonski protitelesi proti CD20 rituksimab in ofatumumab sta izkazali sinergistično delovanje s PgE1-OH na celični liniji Ramos. Preliminarni rezultati pri celicah KLL prav tako izkazujejo sinergistično delovanje PgE1-OH z anti-CD20 monoklonskimi protitelesi in nadalje potrjujejo pomen EP4 kot potencialne tarče v terapiji KLL. Pri uporabi monoklonskega protitelesa proti CD52, alemtuzumaba, sinergističnih učinkov z agonistom receptorja EP4 nismo zaznali. Ugotovili smo, da agonist receptorja EP4 deluje kemosenzitivno z anti-CD20 monoklonskimi protitelesi na malignih limfocitih B, kar lahko odpira nove možnosti za zdravljenje B-celičnih levkemij in limfomov. [T. Markovič]20182022-06-15 13:12:59Doktorska disertacija137379sl