Načrtovanje zaviralcev bakterijskih avtolitičnih encimov N-acetil glukozaminidazTibaut, Tjaša (Avtor) Novič, Marjana (Mentor) Anderluh, Marko (Komentor) protibakterijske učinkovinenačrtovanjebakterijecelična stenapeptidoglikanmetabolizemencimiavtoliziniavtolizin EN-acetilglukozaminidazaencimi Murencimski inhibitorjiknjižnice spojinvirtualno rešetanjevezavna mestadisertacijeV sklopu doktorske disertacije smo študirali encime odgovorne za metabolizem peptidoglikana, ki je glavna sestavina bakterijske celične stene. Osredotočili smo se na naslednje encime:  avtolizin E (AtlE) – N-acetil glukozaminidazo, ki je odgovorna za razgradnjo PG,  encime Mur, ki sintetizirajo osnovne gradnike peptidoglikana. Izgradnja in razgradnja PG sta v bakterijski celici v ravnotežju, porušenje tega ravnotežja v eno ali drugo smer pa vodi v odmiranje bakterij ali nezmožnost razmnoževanja. Prvi dve poglavji v disertaciji opisujeta delo v okviru prve hipoteze, ki predpostavlja, da obstajajo podobnosti med vezavnimi mesti med encimov, ki sodelujejo pri metabolizmu PG. Uvodoma smo s pomočjo različnih računalniških programov za napovedovanje vezavnih mest poiskali žepe na površini AtlE ter definirali katalitično vezavno mesto. Nadalje smo v raziskave vključili tudi človeški lizocim, encime Mur in enega od encimov, ki spada med »proteine, ki vežejo peniciline«. Za vse naštete encime je značilno, da so njihovi substrati zelo podobni ligandom iz kompleksa kristalne strukture encima AtlE. Zaporedja in strukture lizocima in slednjih smo primerjali z encimom AtlE. Primerjava ni pokazala podobnosti med encimi, ki izgrajujejo in encimi, ki razgrajujejo PG (avtolizini), je pa zelo podobna struktura in sestava katalitičnega vezavnega mesta pri avtolizinih iz različnih vrst bakterij. Podobnost je opazna tudi med samimi encimi Mur, na katerih je bilo testiranih dovolj spojin, da smo za Mur A in Mur B pripravili klasifikacijske modele za napoved jakosti zaviralcev. Poleg tega, da imajo vsi encim Mur rešene 3D strukture, so nekateri izmed njih dobro poznane že validirane tarče. Izgradnjo klasifikacijskih modelov opisuje tretje poglavje v disertaciji. V zadnjih dveh poglavjih je opisana uporaba strukturno podprtega načrtovanje ligandov za encim AtlE. Pri tem smo uporabili dva pristopa: virtualno rešetanje knjižnice majhnih molekul (fragmentov) ter načrtovanje novega razreda ligandov (de novo) na podlagi karakteristik vezavnega mesta. Obetavne spojine iz virtualnega rešetanja smo kupili, de novo načrtovane pa sintetizirali. Vezavo pridobljenih spojin z encimom smo izmerili s površinsko plazmonsko resonanco (angl. surface plasmon resonance ali SPR), biofizikalno metodo za določanje medmolekulskih interakcij. Pridobili smo dva fragmenta z afiniteto vezave v mikromolarnem območju, medtem ko večina ostalih fragmentov kaže trend nestehiometrične vezave, kar pomeni, da se spojine vežejo na več kot eno mesto na proteinu. Tekom študija smo uspeli pridobiti uporabne informacije o vezavnih mestih ter ligandih encimov, ki so odgovorni za metabolizem peptidoglikana. Informacije o vezavnih mestih AtlE ter fragmenti, katerim smo uspeli dokazati interakcije z encimom, lahko pripomorejo k nadaljnjemu razvoju zaviralcev avtolizinov. Klasifikacijski modeli za napovedovanje jakosti zaviralcev encimov Mur so uporabno orodje za razvoj učinkovin, ki zavirajo sintezo peptidoglikana. Povzamemo lahko, da smo z opisanimi študijami naredili korak naprej pri razvoju zaviralcev encimov, ki so dogovorni za metabolizem peptidoglikana.[T. Tibaut]20192022-06-10 10:53:07Doktorska disertacija137323sl