Vloga cistatina F in cisteinskih katepsinov pri delovanju citotoksičnih limfocitov TPrunk, Mateja (Avtor) Kos, Janko (Mentor) biomedicinaklinična biokemijaimunski sistemmolekularna imunologijacitotoksični limfociti Tnaravne celice ubijalkecitotoksičnostperforingrancimcisteinski katepsinikatepsin Ckatepsin Hkatepsin Lcistatinicistatin Fdoktorske disertacijeCitotoksični limfociti T CD8+ (CTL) in naravne celice ubijalke (celice NK) imajo ključno vlogo v imunskem odzivu proti celicam, okuženim z virusi in proti rakavim celicam, saj jih lahko neposredno ubijejo. CTL in celice NK se bistveno razlikujejo v načinih aktivacije, vendar pa so molekularni mehanizmi, ki jih uporabljajo za ubijanje tarčnih celic, pri obeh vrstah citotoksičnih limfocitov enaki. Najpomembnejše je ubijanje preko perforin/grancimske poti, pri kateri citotoksični limfociti izločijo vsebino posebnih sekretornih lizosomov, ki jih imenujemo citotoksična zrna. Glavne citotoksične molekule, prisotne v citotoksičnih zrnih, so perforin, protein, ki omogoči vstop grancimom v citosol tarčne celice, ter grancimi, družina serinskih peptidaz, ki v tarčni celici sprožijo celično smrt. Tako perforin kot grancimi se sintetizirajo v neaktivni prekurzorski obliki, za njihovo aktivacijo pa je potrebno proteolitično procesiranje, kjer imajo ključno vlogo cisteinski katepsini. Za aktivacijo grancimov je tako potrebno delovanje katepsinov C in H, medtem ko katepsin L aktivira perforin. Aktivnost cisteinskih katepsinov je uravnavana na različnih nivojih, pomembno je uravnavanje z njihovimi endogenimi proteinskim inhibitorji, cistatini. Med cistatini je v citotoksičnih limfocitih še posebej pomembno delovanje cistatina F, saj je edini cistatin, ki se nahaja v endosomih/lizosomih in lahko uravnava delovanje cisteinskih katepsinov, prisotnih v teh veziklih. Poleg tega se cistatin F iz celic izloča, zunajcelični cistatin F pa lahko privzamejo druge celice, privzeti cistatin F nato uravnava delovanje njihovih endogenih cisteinskih katepsinov. Nedavno je bilo pokazano, da se nivo cistatina F poviša po vzpostavitvi delne anergije celic NK, tj. stanja zmanjšane citotoksičnosti in povečanega izločanja citokinov. Poleg tega je zunajcelični cistatin F zmanjšal tako aktivnost grancimov A in B kot samo citotoksičnost celic NK, kar kaže na pomembno vlogo cistatina F pri uravnavanju delovanja celic NK. Vloga cistatina F pri delovanju CTL pa nasprotno še ni poznana, poleg tega ni dokazan vpliv zunajceličnega cistatina F na aktivnost cisteinskih katepsinov v človeških citotoksičnih limfocitih. V okviru doktorske disertacije smo tako najprej raziskali pomen cistatina F pri anergiji CTL. Najprej smo vzpostavili dva anergična modela na celični liniji TALL-104, z uporabo nizke koncentracije ionomicina ter z imunosupresivnim citokinom transformirajočim rastnim dejavnikom β (TGFβ). Ugotovili smo, da je pri obeh modelih citotoksična sposobnost celic TALL-104 močno zmanjšana proti različnim tarčnim celicam, to je celicam K-562, ki jih ubijajo tudi celice NK, ter proti celicam Raji, ki jih celice NK ne ubijajo. Potrdili smo, da pri naših modelih ni vpliva na živost celic ter da ubijanje tarčnih celic temelji na perforin/grancimski poti. Zmanjšana citotoksičnost je pri obeh modelih sovpadala s povišanimi nivoji aktivne monomerne oblike cistatina F ter celokupnih nivojev cistatina F, medtem ko je bil nivo neaktivne dimerne oblike po tretiranju s TGFβ zmanjšan, po tretiranju z nizkimi koncentracijami ionomicina pa povišan. Aktivacija CTL je povzročila zmanjšanje nivojev tako monomerne kot dimerne oblike cistatina F, medtem ko je nivo cistatina F po aktivaciji anergičnih celic ostal povišan. Potrdili smo tudi interakcijo cistatina F s katepsinoma C in H z imunoprecipitacijo v TALL-104, ter ko-lokalizacijo s katepsini C, H in L v TALL-104 in primarnih človeških limfocitih T CD8+ (pCTL). Nato smo pokazali, da je višji nivo aktivnega monomernega cistatina F povezan ne le z manjšo citotoksičnostjo, temveč tudi z zmanjšano specifično aktivnostjo katepsinov C, H in L ter končne efektorske peptidaze perforin/grancimske poti, grancimom B. Dobljeni rezultati opredeljujejo pomen cistatina F pri anergiji CTL. V naslednjem delu raziskav smo najprej potrdili lokalizacijo cistatina F v citotoksičnih zrncih, saj je cistatin F ko-lokaliziral s perforinom v celicah TALL-104, poleg tega smo dokazali ko-lokalizacijo cistatina F in grancima B z ligacijskim testom bližine v celicah TALL-104 in pCTL. Nato smo ocenili vpliv zunajceličnega cistatina F na katepsine C, H in L. Dodajanje rekombinantnega človeškega neskrajšanega ali N-končno skrajšanega cistatina F je zmanjšalo aktivnosti katepsinov C, H in L v celicah TALL-104, pri čemer je bil vpliv N-končno skrajšane različice na aktivnosti katepsinov C in H nekoliko večji, vendar ni bil statistično značilen. Preverili smo, ali inhibicija katepsina L vpliva na aktivacijo katepsina C. Pokazali smo, da v celicah HeLa transfekcija s cistatinom F zmanjša aktivacijo katepsina C, vendar pa dodajanje cistatina F celicam TALL-104 na procesiranje katepsina C ni vplivalo. Poleg tega inhibicija katepsina L ni imela vpliva na procesiranje perforina, najverjetneje so zmanjšano aktivnost katepsina L nadomestile druge peptidaze. Po drugi strani pa je dodajanje neskrajšane in N-končno skrajšane različice cistatina F izrazito zmanjšalo aktivnost efektorskih peptidaz citotoksičnosti, grancimov A in B, vpliv N-končno skrajšane različice je bil statistično značilno večji od vpliva neskrajšane različice. V zadnjem sklopu raziskav smo dokazali, da dodajanje obeh različic cistatina F, neskrajšane in N-končno skrajšane, tudi neposredno zmanjša citotoksičnost celic TALL-104. S tem smo dokazali, da zunajcelični cistatin F lahko regulira citotoksično delovanje CTL preko vpliva na aktivnost cisteinskih katepsinov C in H ter s tem na aktivacijo grancimov A in B. Poleg tega pa smo pokazali, da lahko citotoksičnost CTL zmanjša tudi vsebnost cistatina F v tarčnih celicah, saj so celice TALL-104 manj učinkovito ubijale celice K-562, ki smo jih inkubirali s cistatinom F in so cistatin F privzele, kot celice K-562, ki jih nismo inkubirali s cistatinom F. Rezultati kažejo, da cistatin F v tarčnih celicah lahko deluje zaščitno za tarčne celice in prepreči njihovo ubijanje s strani citotoksičnih celic. V okviru doktorske disertacije smo tako pokazali vpletenost cistatina F v vzpostavitev in vzdrževanje anergičnega stanja CTL ter vpliv privzemanja zunajceličnega cistatina F, ki neposredno uravnava citotoksičnost CTL preko delovanja na pro-grancimski konvertazi, katepsina C in H. Hkrati smo pokazali, da lahko na citotoksičnost CTL vpliva tudi cistatin F, ki se nahaja v tarčnih celicah, kar je predvsem zanimivo v luči protitumorskega imunskega odziva, saj predstavlja enega od mehanizmov, kako bi se rakave celice izognile imunskemu nadzoru. Z uravnavanjem aktivacije cistatina F preko uravnavanja aktivnosti peptidaz, ki aktivirajo cistatin F, oziroma z uravnavanjem privzemanja cistatina F preko vpliva na njegov glikozilacijski profil, bi lahko uravnavali citotoksičnost CTL, kar bi bilo pomembno pri imunoterapiji raka ter boleznih, pri katerih je moteno citotoksično delovanje citotoksičnih limfocitov. [M. Prunk]20192022-06-10 10:43:53Doktorska disertacija137320sl