Načrtovanje, izdelava in vrednotenje polielektrolitnih nanodelcev za peroralno dostavo proteinskih učinkovinMiklavžin, Ana (Avtor) Kristl, Julijana (Mentor) Cegnar, Mateja (Komentor) farmacevtska tehnologijatehnologija rekombinantne DNAzdravilne učinkovinerekombinantni proteiniterapevtski proteiniperoralna aplikacijadostavni sisteminanodelcinanodostavni sistemirekombinantni humani eritropoetindisertacijeRazvoj rekombinantne tehnologije DNK in biotehnologije je omogočil proizvodnjo proteinov v industrijskem merilu ter jih povzdignil na nov nivo uporabe. Postali so učinkovine izbora za zdravljenje številnih bolezni zaradi njihove selektivnosti in terapevtske učinkovitosti. Vnos proteinskih učinkovin v telo je danes omejen predvsem na parenteralno dajanje, saj je absorpcija proteinov iz prebavil zaradi strukturnih lastnosti (velikosti molekul, hidrofilnosti, fizikalne, kemijske in proteolitske nestabilnosti) skoraj nična. S tega vidika in stališča pacientov postajata razvoj in uporaba naprednih dostavnih sistemov za peroralno dajanje proteinskih učinkovin vse bolj pomembna. Ena izmed naprednih dostavnih oblik za proteinske učinkovine so nanodelci, ki zaradi svojih specifičnih lastnosti predstavljajo obetaven sistem za izboljšanje stabilnosti proteinskih učinkovin in biološke uporabnosti. Mehanizem prehajanja proteinskih učinkovin na ravni membran še ni v celoti pojasnjen, pogledi raziskovalcev pa se razlikujejo zlasti glede na pomen nosilnih materialov za vgrajevanje in posledično na lastnosti in permeabilnost nanodelcev, kar je področje v okviru disertacije. Uvodni del disertacije predstavlja osnovne lastnosti proteinov, načrtovanje, izdelavo ter in vitro in in vivo vrednotenje različnih proteinskih učinkovin in nanodelcev, nato sledijo eksperimenti in rezultati. Proučevali smo humani rekombinantni eritropoietin (EPO), njegov sintezno modificiran konjugat s kaprojsko kislino (mC6EPO), rekombinantni granulocitne kolonije stimulirajoči dejavnik (GCSF), pa tudi ovalbumin v procesih sušenja. Izbrani biokompatibilni polielektroliti v naših raziskavah so hitosan (CS), trimetilhitosan (TMC), kopolimer polimlečne in asparginske kisline, novo sintetiziran in ovrednoten kemijsko modificiran hitosan-graft-poli(L-glutamat) (CS-g-PGlu), alginat in hondroitin sulfat. Nanodelce smo pripravljali s kompleksiranjem proteinskih učinkovin in polielektrolitov v vodnem mediju, ki predstavlja najblažje pogoje in spontan nastanek. Z optimiranim postopkom smo dobili disperzije ND s povprečnim hidrodinamskim premerom med 200 in 300 nm, polidisperznim indeksom pod 0,3 in pri tem ohranili biološko aktivnost vgrajenih proteinov. V predformulacijskih študijah smo sprva proučili površinsko hidrofobnost prostega in v nanodelce vgrajenega EPO in njen vpliv na transepitelno prehajanje. Površinske lastnosti EPO smo ugotavljali s spreminjanjem intenzitete fluorescence spojine bis-ANS. Dokazali smo, da se hidrofobnost površin proteinov spreminja z variiranjem pH okolja in kompleksiranjem s polielektrolitom(i). Najvišjo površinsko hidrofobnost so izkazovali izdelani CS nanodelci z vgrajenim EPO, sledil je prost EPO, najnižjo pa CS-TMC ND z vgrajenim EPO. Največji permeabilnostni koeficient za EPO skozi epitelijski monosloj Caco-2 celic smo izmerili za CS nanodelce, ki so imeli tudi najvišjo hidrofobnost. Dokazali smo, da se pri kompleksiranju hidrofilnih proteinov s pH-občutljivimi polielektroliti zmanjša gostota nabojev in s tem poveča površinska hidrofobnost. Primerljivo obnašanje so pokazali nanodelci hitosan/mC6EPO/tripolifosfat, pa tudi hitosan/ovalbumin/kopolimer polimlečne in asparginske kisline in alginat/ovalbumin/hitosan. Novo sintetizirane hitosan-graft-poli(L-glutamat) kopolimere s 5, 10 ali 15 molekul dolgimi verigami smo uporabili za pripravo ND z GCSF in jih obložili s TMC. Dokazali smo, da dolžina pripetih verig statistično značilno poveča kapaciteto polielektrolita za kompleksiranje GCSF. Odkrili smo, da je za medsebojne interakcije proteinskih učinkovin s polielektroliti pomembna gostota naboja in strukturna dostopnost skupin. V izdelane ND se vgradi do 45 % GCSF, nanodelci pa so bili stabilni v temperaturnem območju med 25° - 39°C in pH vrednostih pod izoelektrično točko GCSF (pI 6,1) daljši čas. S pripravo EPO konjugata s kaprojsko kislino (mC6EPO) smo izboljšali naslednje lastnosti proteina kot so višja vgradnja v ND, delna zaščita pred kislinsko in encimsko razgradnjo ter povečano prehajanje skozi monosloj Caco-2 celic v primerjavi s prostim EPO. Z dodatkom pospeševalca absorpcije CYMAL v ND smo še izboljšali prehajanje tako za EPO kot mC6EPO glede na prost EPO v primerjavi brez pospeševalca absorpcije (prehajanje EPO se izboljša za 1186 krat in mC6EPO za 927 krat). Izdelani nanodelci z vključenim EPO in mC6EPO ter CYMAL so zaščitili protein pred encimsko razgradnjo, ohranila se je biološka aktivnost vgrajenih proteinov, kar smo dokazali s farmakološkim odzivom EPO in mC6EPO pri poskusnih živalih. Shranjevanje nanodelcev z občutljivimi proteinskimi učinkovinami za daljše časovno obdobje predstavlja raziskovalcem velik izziv. Z raziskovanjem liofilizacije tekočih disperzij nanodelcev s proteinsko učinkovino smo dokazali, da lahko z izborom ustreznih krio- in lio- protektantov (kot optimalna sta se izkazala trehaloza in manitol) uspešno izdelamo suhe nanodelce, ki tvorijo po redispergiranju v vodi disperzijo s podobnimi lastnostmi kot jih imajo pred sušenjem. Kot prvi smo v postopek sušenja disperzije nanodelcev vpeljali sušenje z razprševanjem disperzije ND v tekoči dušik (spray-freeze drying) in dobili sipek prašek. Rezultati eksperimentov v okviru doktorske disertacije nedvoumno dokazujejo odločilen pomen izbranih polielektrolitov za izdelavo nanodelcev s proteinskimi učinkovinami. Blagi tehnološki pogoji, nanometrska velikost delcev, visoka učinkovitost vgrajevanja proteina v komplekse, spremenjena površinska polarnost nanodelcev in pH-občutljivo sproščanje so obetavne možnosti za razvoj ustreznega dostavnega sistema za peroralni vnos proteinskih učinkovin. Ugotavljamo, da polielektrolitni nanodelci prinašajo preobrat v oblikovanje nosilnih sistemov za proteinske učinkovine v primerjavi s konvencionalnimi farmacevtskimi oblikami in omejitvami znanih tehnoloških pristopov. Temeljni cilj raziskav v okviru disertacije je bil torej dopolnitev znanja o mehanizmu vgrajevanja terapevtskih proteinov v polimerne nanodelce in njihovem vplivu na prehajanje bioloških membran, pa tudi pretvorba tekočih disperzij nanodelcev v suho, stabilno stanje, kar skupno predstavlja osnovo za učinkovitejšo terapevtsko uporabo. [A. Miklavžin]20192022-06-10 10:37:29Doktorska disertacija137319sl