In vivo enkapsulacija specifičnih fragmentov DNA v bakterijski mikrorazdelekOtoničar, Jan (Avtor) Butala, Matej (Mentor) bakterijski mikrorazdelekenkapsulacija DNAtranskripcijski faktorBakterijski mikrorazdelki so primitivni proteinski organeli, ki jih sintetizira okrog 20 % bakterijskih vrst, katerih zaporedje genoma je določeno. Njihova glavna naloga je izboljševanje učinkovitosti posameznih metabolnih reakcij ali preprečitev akumulacije toksičnih metabolitov v citoplazmi. V osnovi jih delimo na tiste, ki sodelujejo v anabolizmu in na tiste, ki sodelujejo v katabolizmu celice. Med slednjimi je najbolj znan mikrorazdelek Pdu, ki je bil zaradi modularnosti uporabljen že za več biotehnoloških aplikacij. V magistrskem delu smo prikazali novo aplikacijo, in sicer enkapsulacijo specifičnega fragmenta DNA, kar bi lahko služilo kot osnova metode za odkrivanje interakcij protein-DNA ali kot ogrodje za metabolni inženiring. Za lažjo izolacijo smo podenoti mikrorazdelka PduA dodali peptidno značko Twin-Strep-tag, ki omogoča afinitetno izolacijo intaktnih mikrorazdelkov. Pokazali smo, da se fuzijski protein PduD(1-18)-LacI-EGFP učinkovito enkapsulira v mikrorazdelke in vivo ter po afinitetni izolaciji mikrorazdelkov ostane funkcionalen. Pripravili smo sistem dveh plazmidov v Escherichia coli, ki je aktiviran z dodatkom arabinoze v gojišče. Z enega plazmida se začnejo izražati geni za kvasno restriktazo I-SceI, protein Gam, podenote mikrorazdelka Pdu in gen za fuzijski protein PduD(1-18)-LacI-EGFP. Na drugem plazmidu sta eno ali dve restrikcijski mesti za kvasno restriktazo I-SceI, ki obdajata vezavna mesta za LacI. Z visokozmogljivim sekvenciranjem smo dokazali, da je DNA fragment z vezavnimi mesti za protein LacI v afinitetno izoliranih mikrorazdelkih Pdu obogaten glede na druge regije genoma, kar kaže na to, da je bil ta fragment uspešno enkapsuliran. Dokažemo tudi, da lahko v mikrorazdelek Pdu enkapsuliramo DNA z vezavnimi mesti za vsaj dva transkripcijska faktorja.[J. Otoničar]20222022-06-04 07:15:06Magistrsko delo/naloga137166sl