Imunogenost infliksimaba in adalimumaba ter njun vpliv na vnetno stimulirane humane endotelijske celice koronarne arterijeOgrič, Manca (Avtor) Čučnik, Saša (Mentor) Praprotnik, Sonja (Komentor) Božič, Borut (Član komisije za zagovor) Tomšič, Matija (Član komisije za zagovor) Štrukelj, Borut (Član komisije za zagovor) infliksimabadalimumabimunogenostBiološka zdravila (monoklonska protitelesa), usmerjena proti specifičnim molekulam, med katerimi sta tudi infliksimab in adalimumab, so pomembno spremenila področje zdravljenja kroničnih vnetnih črevesnih in revmatskih bolezni. Infliksimab in adalimumab sodita v skupino zaviralcev dejavnika tumorske nekroze α, ki igra pomembno vlogo v patogenezi omenjenih bolezni. Zdravljenje z biološkimi zdravili je uspešno v približno 60–70 % in je večinoma povezano z remisijo bolezni. Poleg originalnih bioloških zdravil so dostopna tudi že podobna biološka zdravila, ki izkazujejo primerljivost tako v varnosti kot učinkovitosti zdravljenja, imajo pa med seboj določene strukturne razlike (npr. posttranslacijske modifikacije, kot so glikozilacije). Vsa biološka zdravila so imunogena, posledica česar je izguba odziva na zdravljenje zaradi nastanka protiteles, usmerjenih proti biološkemu zdravilu. Nastajajo klinično pomembna nevtralizacijska protitelesa, ki so usmerjena proti idiotopom na vezavnem mestu za dejavnik tumorske nekroze α, in nenevtralizacijska, ki so usmerjena proti drugim delom protitelesa. S spremljanjem nivojev zdravil in protiteles proti biološkim zdravilom lahko uspešno optimiziramo zdravljenje. Dodaten izziv pri terapevtskem spremljanju koncentracij bioloških zdravil predstavlja izbor metod, saj se te med seboj razlikujejo. Največje razlike so pri metodah za določanje protiteles proti biološkim zdravilom, in sicer v samih principih in načinih kvantifikacije protiteles. Poleg težav, vezanih na biološko zdravljenje, bolnike z revmatoidnim artritisom ogroža zvišano tveganje za pojav ateroskleroze in zgodnji razvoj srčno-žilnih bolezni v primerjavi s skupino, ki omenjene bolezni nima. V patološke procese sta tako pri aterosklerozi kot tudi pri revmatoidnem artritisu vključena dva glavna citokina: interlevkin 1β in dejavnik tumorske nekroze α. V okviru hipotez smo predpostavljali, da bomo z uvedbo hišne encimskoimunske metode na trdnem nosilcu za detekcijo nivojev biološke učinkovine/biološkega zdravila (infliksimab in adalimumab) ter specifičnih protiteles proti njej pokazali navzkrižne reaktivnosti med originalnimi, podobnimi biološkimi zdravili in protitelesi proti njim. Predvidevali smo tudi, da je z uporabo metodološkega algoritma, torej kombinacije detekcijskih metod, mogoče določiti najustreznejše nivoje biološkega zdravila in protiteles proti njemu, ki so tudi klinično pomembna. Navzkrižno reaktivnost med biološkimi zdravili, tako originalnimi kot podobnimi biološkimi zdravili, in protitelesi proti njim, smo preverjali z uporabo hišnih encimskoimunskih metod na trdnem nosilcu. V hišnih encimskoimunskih metodah na trdnem nosilcu za določanje infliksimaba uporabljamo podobno biološko zdravilo Remsima® kot standard, v premostitveni encimskoimunski metodi na trdnem nosilcu za določanje protiteles proti infliksimabu pa kot antigen in detekcijsko protitelo. Navzkrižno reaktivnost med originalnim zdravilom infliksimaba Remicade®/podobnim biološkim zdravilom infliksimaba Remsima® in njunimi protitelesi smo preverjali v dveh delih. V prvem sklopu določanja navzkrižne reaktivnosti smo analizirali zaporedno zbrane vzorce bolnikov, zdravljenih z Remsimo® ali Remicade®, obolelih z eno od kroničnih vnetnih revmatskih ali črevesnih bolezni. Rezultate hišne metode smo primerjali z rezultati, dobljenimi s komercialnim analiznim kompletov, kjer v reagentih uporabljajo zdravilo Remicade®. Z računanjem korelacij med rezultati obeh metod smo pokazali, da detekcijsko protitelo, ki je usmerjeno proti Remicade®, navzkrižno reagira tako z Remsimo® kot z Remicade®. V drugem sklopu pa smo vzorce bolnikov, ki so bili zdravljeni z Remsimo® ali Remicade® in ki so imeli nezaznavne nivoje zdravila, analizirali s hišno in komercialno premostitveno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu. Komercialna metoda ima za razliko od hišne, kjer je antigen Remsima®, na svoji ploščici vezan antigen Remicade®. Korelacijski koeficienti med rezultati dveh metod kažejo visoko ujemanje in dokazujejo navzkrižno reaktivnost med originalnim/podobnim biološkim zdravilom infliksimaba in protitelesi. Prav tako smo dokazovali navzkrižno reaktivnost med originalnim/podobnimi biološkimi zdravili adalimumaba in protitelesi proti njim v dveh delih. V prvem delu smo pripravili vzorce z znanimi koncentracijami originalnega zdravila Humire® in vzorce z znanimi koncentracijami podobnih bioloških zdravil Amgevite® in Imraldi® ter jih analizirali v hišni encimskoimunski metodi na trdnem nosilcu za določanje adalimumaba, kjer se uporablja Humiro® kot standard in detekcijsko protitelo, usmerjeno proti Humiri®. Pokazali smo, da s testiranjem vzorcev z znano koncentracijo treh zdravil adalimumaba s hišno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu za določanje adalimumaba točno in natančno določimo koncentracije zdravil Humire®, Amgevite® in Imraldi®. To pomeni, da detekcijsko protitelo navzkrižno reagira z vsemi tremi zdravili adalimumaba. V drugem delu smo testirali vzorce bolnikov s prisotnimi protitelesi proti adalimumabu in dokazovali navzkrižno reaktivnost protiteles s Humiro®, Amgevito® in Imraldi®. Omenjena tri zdravila smo uporabili kot antigene na plošči v hišni premostitveni encimskoimunski metodi na trdnem nosilcu. Rezultati so pokazali, da protitelesa proti adalimumabu navzkrižno reagirajo tako s Humiro® in Amgevito® kot tudi z Imraldi®. Pokazali smo, da lahko terapevtsko spremljamo nivoje bioloških zdravil kot tudi nivoje protiteles proti njim pri bolnikih, zdravljenih s podobnimi biološkimi zdravili, kakor tudi pri bolnikih, zdravljenih z originalnim zdravilom, in tako posledično s finančno učinkovitostjo pridemo do enako zanesljivih in ponovljivih rezultatov ter rešimo možni problem navzkrižne reaktivnosti. Rezultate, pridobljene tekom dokazovanja navzkrižne reaktivnosti, smo združili z rezultati primerjave različnih detekcijskih metod in tako postavili metodološki algoritem. V sklopu metodološkega algoritma v prvem koraku vsem vzorcem določamo nivo biološkega zdravila in le vzorcem, ki imajo nezaznavne nivoje zdravila, določamo protitelesa proti biološkim zdravilom. Vse metode za določanje protiteles proti biološkim zdravilom, uporabljene tekom eksperimentalnega dela doktorske naloge, imajo svoje prednosti in slabosti. Premostitvena encimskoimunska metoda na trdnem nosilcu, sicer najpogosteje uporabljena metoda, zazna tako nevtralizacijska kot tudi nenevtralizacijska protitelesa, ne zazna pa imunoglobulinov razreda G4 zaradi njihove bi-specifičnosti. Celična funkcijska metoda je zaradi svoje metodologije, kjer se uporabljajo transfecirane celice, finančno neugodna. Zato smo v sklopu doktorske naloge razvili in ovrednotili kompetitivno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu, ki posnema metodologijo celične funkcijske metode. Rezultate, dobljene s kompetitivno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu, smo najprej primerjali z rezultati hišne premostitvene encimskoimunske metode na trdnem nosilcu in celičnega funkcijskega testa. Korelacijski koeficienti so pokazali odlično ujemanje med rezultati. Rezultati so pokazali, da s kompetitivno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu zaznamo protitelesa proti biološkim zdravilom v kar do 19 % več vzorcev. Dobljeni rezultati so nam dali osnovo za dvostopenjsko določanje protiteles proti biološkim zdravilom. Vzorce z nezaznavnimi nivoji biološkega zdravila torej najprej analiziramo s premostitveno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu. V kolikor s premostitveno encimskoimunsko metodo protiteles ne določimo, vzorce naprej testiramo s kompetitivno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu. Z uporabo metodološkega algoritma ohranimo utečeno in širše sprejeto prakso določanja protiteles proti biološkim zdravilom s klinično ovrednoteno premostitveno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu. Z dodatnim testiranjem vzorcev s kompetitivno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu zaznamo protitelesa v večjem deležu vzorcev in posledično tudi prej kot s premostitveno encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu. V nadaljevanju pa smo predpostavljali in tudi dokazali, da biološko zdravilo in protitelesa proti biološkemu zdravilu modulirajo vnetni odziv z dejavnikom tumorske nekroze α-, interlevkinom 1β- in serumskim amiloidom A-stimuliranih humanih endotelijskih celic koronarne arterije v kulturi. Humane endotelijske celice koronarne arterije smo inkubirali z dejavnikom tumorske nekroze α, interlevkinom 1β, serumskim amiloidom A, adalimumabom, infliksimabom, protitelesi proti infliksimabu in njihovimi kombinacijami. Protitelesa proti infliksimabu smo izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije iz serumskih vzorcev dveh bolnic. V supernatantih celic smo merili proteinske nivoje aterogenih in protiaterogenih analitov z encimskoimunsko metodo na trdnem nosilcu in metodo hkratnega določanja večjega števila analitov. Izražanje informacijske ribonukleinske kisline smo določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času. Vloge posameznih naštetih stimulatorjev so bile predhodno že pokazane, medtem ko smo sinergijo med njimi prvi pokazali tekom doktorskega dela skupaj z učinki zaviralcev dejavnika tumorske nekroze α in njihovimi protitelesi. Naši rezultati so pokazali, da se analiti, analizirani v supernatantih celic, razvrščajo v dve skupini. Analiti iz prve skupine, interlevkin 6, interlevkin 8, granulocitne in makrofagne kolonije stimulirajoči dejavnik ter z rastjo reguliran onkogen α, ki so malo odzivni na posamezno stimulacijo s serumskim amiloidom A in dejavnikom tumorske nekroze α ter zelo odzivni na interlevkin 1β in pri katerih opazimo sinergistični učinek pri stimulaciji z vsemi tremi stimulatorji, so vsi povezani s pojavom ateroskleroze. Med analiti druge skupine, kjer sinergističnega učinka pri stimulaciji z dejavnikom tumorske nekroze α, interlevkinom 1β in serumskim amiloidom A ne opazimo, sta najbolj zvišana žilna celična adhezijska molekula-1 in monocitni kemotaktični protein-1, ki ju prav tako povezujemo z nastankom ateroskleroze. V eksperimentih, kjer smo uporabljali koncentracije infliksimaba in adalimumaba, ki v serumu bolnikov predstavljajo klinično pomembne koncentracije, naši rezultati kažejo na inhibicijo vnetnega delovanja dejavnika tumorske nekroze α ter potencialno vpletenost infliksimaba in adalimumaba v zmanjševanje aktivacije endotelija. Pojav protiteles proti biološkim zdravilom pri bolnikih lahko, v kolikor so le-ta dolgo prisotna, vpliva tako na odpoved zdravljenja primarne bolezni kot tudi na razvoj ateroskleroze. Rezultati doktorske naloge pomembno sooblikujejo poznavanje navzkrižnih reaktivnosti med originalnimi/podobnimi biološkimi zdravili in protitelesi proti njim ter prikazujejo razvoj stopenjskega odkrivanja protiteles preko uporabe metodološkega algoritma v dejanski rutinski praksi. Izsledki celičnih eksperimentov kažejo sinergistične učinke dejavnika tumorske nekroze α, interlevkina 1β in serumskega amiloida A na humane endotelijske celice koronarne arterije z merjenjem različnih molekul, vpletenih v razvoj ateroskleroze, ter vpletenost adalimumaba, infliksimaba in protiteles proti infliksimabu v vnetne procese. Rezultati nakazujejo prepletanje signalnih poti dejavnika tumorske nekroze α v patogenezi revmatskih bolezni in v aterosklerozi. [M. Ogrič]20202022-06-01 12:11:16Doktorska disertacija137113sl