Priprava in analiza rekombinantega signalnega kompleksa znotrajcelične domene EpCAM s proteini FHL2, β-kateninom in Lef-1Prešern, Uroš (Avtor) Gaber, Aljaž (Mentor) EpCAMβ-kateninFHL2Lef-1proteinska interakcijaEpCAM je transmembranski glikoprotein, ki je pretirano izražen na površini številnih karcinomov. Eden od mehanizmov, preko katerih sodeluje pri razvoju in napredovanju raka, je regulirana intramembranska proteoliza, med katero se v citosol sprosti njegova znotrajcelična regija EpIC, ki tvori signalni kompleks s proteini FHL2, β-kateninom in Lef-1. Ta v jedru sproži transkripcijo onkogenov, ki spodbujajo proliferacijo celic. Da bi bolje razumeli delovanje omenjenega procesa, smo želeli pripraviti posamezne komponente signalnega kompleksa in analizirati interakcije med njimi. S tem namenom smo v E. coli izrazili rekombinanten β katenin, Lef-1, FHL2 in EpIC ter proteine očistili. Vzpostavili smo nov protokol izražanja in čiščenja Lef 1 in FHL2 ter optimizirali že obstoječ protokol izražanja in čiščenja β katenina ter različnih oblik EpIC v fuziji s sfGFP. Zaradi nagnjenosti FHL2 k tvorbi inkluzijskih teles, smo protein izrazili v fuzijski obliki z različnimi partnerji, ki izboljšujejo topnost proteina. Pri tem se je za najboljšo izbiro izkazal sfGFP, ker je omogočal visoke izplene izražanja in uspešno odstranitev fuzijskega partnerja med čiščenjem. Po pripravi posameznih proteinov smo izvedli analizo interakcij s SEC in prečnim povezovanjem. S SEC smo uspeli potrditi interakcijo med β-kateninom in FHL2, medtem ko interakcije EpIC z ostalimi komponentami nismo zaznali. S prečnim povezovanjem smo zaznali interakcijo med β kateninom in Lef-1 ter β-kateninom in FHL2. Za razliko od SEC smo zaznali tudi interakcijo EpIC s FHL2 in β-kateninom. Poleg opravljenih analiz vzpostavljen protokol priprave posameznih komponent omogoča izvedbo nadaljnjih raziskav o vlogah posameznih proteinov v kompleksu in interakcijah med njimi.20222022-04-20 13:30:00Magistrsko delo/naloga136225sl