Načrt in karakterizacija inducibilne dimerizacije svežnja štirih vijačnic v sesalski celični liniji HEK293TMalovrh, Benjamin (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) Plavec, Janez (Komentor) de novosveženj štirih vijačnicinducibilna dimerizacijačasovna odzivnostSintezna biologija je veda, ki se ukvarja z načrtovanjem novih biomolekularnih komponent, signalnih poti in kaskad, ter uporabo le-teh za uravnavanje delovanja celic, reprogramiranje organizacije tkiv in organizmov. Primer takšnega modula je tudi de novo načrtovan sintetični protein, ki tvori motiv svežnja štirih vijačnic (angl. four-helical bundle). Modul sestavljajo štiri α-vijačnice obvite med seboj. De novo načrtovani svežnji štirih vijačnic imajo lahko aplikativno vrednost tudi v sesalskih celičnih linijah kot nove dimerizacijske, trimerizacijske ali tetramerizacijske domene. Z ustreznim načrtovanjem sistema smo pokazali, da je mogoče regulirati inducibilno 1:3 dimerizacijo α-vijačnic v sveženj štirih vijačnic, preko cepitve z eno izmed ortogonalnih virusnih proteaz. Katalitično aktivna proteaza cepi vstavljeno cepitveno mesto med dimerizacijskimi moduli svežnja štirih vijačnic in s tem sproži dimerizacijo. Virusne proteaze smo uporabili tudi v razcepljeni neaktivni obliki, aktivnost katerih se ob ustrezni prostorski razporeditvi povrne. Prostorsko približevanje cepljenih domen smo izvedli preko sistema kemijsko uravnane dimerizacije dveh različnih domen, ki imata preko peptidnega povezovalca vezane domene razcepljenih proteaz. Ob dodatku ustreznega kemijskega induktorja, je prišlo do dimerizacije domen receptorja za induktor, prostorskega približevanja cepljenih proteaznih domen in s tem povrnitve katalitične aktivnosti. Časovna odzivnost pripravljenega sistema je hitrejša od transkripcijske regulacije in omogoča štirikratno povišanje signala v časovnem razponu 2 h. Uspešnost dimerizacije svežnja štirih vijačnic smo preverjali s povrnitvijo luciferazne aktivnosti. Luciferazni reporter je mogoče nadomestiti z drugimi celičnimi komponentami in tako preko svežnja štirih vijačnic uravnavati ali zaznavati številne celične procese.20212022-02-18 13:51:19Magistrsko delo/naloga135049sl