Določanje funkcije proteaze CrMCA-I iz organizma Chlamydomonas reinhardtiiPeric, Tanja (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) metakaspazeCrMCA-IChlamydomonas reinhardtiioksidativni stresKaspaze so živalskecisteinske proteaze, ki igrajo odločilno vlogo pri regulaciji in izvedbi programirane celične smrti. Kaspaz pri neživalskih evkariontih ni, lahko pa tam najdemo njihove strukturne homologe, metakaspaze. Te ločimo na tri tipe, ki se med seboj razlikujejo po strukturi. Njihova natančna funkcija ni znana, je pa verjetno med drugim povezana tudi z odzivom na oksidativni stres. V sklopu magistrskega dela smo se osredotočili na metakaspazo tipa I iz enocelične zelene alge Chlamydomonas reinhardtii, CrMCA-I. Piprava divjega tipa te proteaze v E. coli ni bila uspešna, saj se je ta proteaza sprva agregirala v netopni frakciji, dokler ji nismo odstranili hidrofobne N-končne regije in zanke 360, ki je značilna za metakaspaze tipa I iz organizmov iz klada Viridiplantae. Tako modificiran CrMCA-I (CrMCA-I_CL) smo izrazili v E. coli in ga izolirali. Podobno smo modificirali tudi zapisa za dve metakaspazi tipa I iz modelne rastline Arabidopsis thaliana, AtMCA-Ia in AtMCA Ib, vendar nam jih ni uspelo pridobiti v topni frakciji. Izoliranemu CrMCA-I_CL smo določili aktivnost pri različnih koncentracijah kalcijevih ionov in pri različnih pH. Ugotovili smo, da je CrMCA I_CL neaktiven v odsotnosti Ca2+, največjo aktivnost pa doseže v nizkih milimolarnih koncentracijah Ca2+. Njegov pH optimum je v nevtralnem. Poleg tega smo poskusili nemodificirano obliko CrMCA-I izraziti tudi v C. reinhardtii. Pri tem smo naleteli na težave z vzpostavljanjem stabilnih kolonij po transformaciji celic. Uspelo nam je pridobiti kolonije na trdnem gojišču z antibiotikom, vendar te kolonije po inokulaciji v tekoče gojišče niso zrasle. Da bi ugotovili, ali lahko s protitelesi, ki so bila ustvarjena proti metakaspazi GtMCA-III, spremljamo prisotnost metakaspaz pri odzivu na oksidativni stres, smo pri divjem tipu C. reinhardtii in pri insercijski mutanti C. reinhardtii CrMCA I::AphVII inducirali oksidativni stres. Glede na to, da metakaspaz s protitelesi v vzorcih nismo zaznali, bomo v prihodnje morali za njihovo prisotnost in aktivnost pri oksidativnem stresu uporabiti drugačne metode.20222022-01-05 09:25:00Magistrsko delo/naloga134306sl