Priprava plazmidnih vektorjev za izbitje in prekomerno izražanje gena FUBP3Srpčič, Anja (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) Lovšin, Marija Nika (Komentor) FUBP3osteoporozamolekulsko kloniranjeCRISPR/Cas9V vsegenomskih asociacijskih študijah (GWAS) so do sedaj odkrili že več kot 150 genskih lokusov, povezanih z mineralno kostno gostoto. Ti genski lokusi predstavljajo potencialne označevalce za zgodnje odkrivanje osteoporoze ali pa potencialne nove tarče za zdravljenje. Eden izmed novo odkritih lokusov je enonukleotidni polimorfizem rs7851693 v intronu gena za FUBP3 (“Far upstream binding protein 3”). O vlogi proteina FUBP3 pri metabolizmu kosti ni še nič znanega. Zato smo v okviru magistrske naloge pripravili plazmidna konstrukta, s katerima bo v nadaljnjih študijah funkcijske genomike mogoče ovrednotiti vpliv spremenjenega izražanja gena FUBP3 na celične procese. Z metodo molekulskega kloniranja po Gibsonu smo sestavili plazmidni konstrukt za povečano izražanje gena FUBP3 (pFLAG-CMV-1-FUBP3) ter plazmidni konstrukt za izbitje gena FUBP3 s sistemom CRISPR/Cas9 (pX459-gRNA1-FUBP3). Za transfekcijo smo izbrali celični liniji HEK 293T, ki izvira iz človeških embrionalnih ledvičnih celic, in A549, ki izvira iz epitelijskih celic pljučnega adenokarcinoma. Po transfekciji konstrukta pFLAG-CMV-1-FUBP v celično linijo HEK 293T smo z metodo prenosa po westernu dokazali, da se izražanje proteina v celici poveča, kar kaže na uspešno pripravljen konstrukt. Spremembo, ki jo je v genomu celic HEK 293T povzročil vstavljeni vektor pX459-gRNA1-FUBP3 (metoda CRISPR/Cas9), smo ovrednotili z določitvijo nukleotidnega zaporedja tarčnega odseka genoma. Z metodo indirektne imunofluorescence smo določili lokalizacijo proteina v celicah. V celični liniji A549 se protein nahaja pretežno v citoplazmi. S plazmidnima konstruktoma, ki smo ju pripravili, smo postavili temelje za izvedbo različnih funkcijskih študij, na podlagi katerih bomo lahko lažje opredelili funkcijo gena FUBP3 in posledice njegove porušene regulacije.20212021-12-15 08:45:11Magistrsko delo/naloga133772sl