Proteinske interakcije človeškega matrina 3Nimac, Jerneja (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) MATR3ALSinterakcijski partnerjiBioIDMatrin 3 (MATR3) je DNA/RNA-vezavni protein jedrnega matriksa, ki je vključen v različne celične procese. Sodeluje pri zgodnjem odzivu na poškodbe DNA, prepisovanju, stabilizaciji mRNA, alternativnem izrezovanju intronov in jedrnem izvozu mRNA. Mutacija S85C v genu MATR3 je povezana z razvojem počasi napredujoče oblike amiotrofične lateralne skleroze (ALS), vendar vloga MATR3 v patogenezi te bolezni ni poznana. Slabo opisane in nepoznane so tudi proteinske interakcije MATR3 in njegovih mutantov. Prav te pa bi bile lahko odgovorne za razvoj ALS. V sklopu magistrskega dela smo želeli z metodo BioID, ki temelji na označevanju bližnjih proteinov z biotinom, identificirati proteine, ki v pogojih in vivo interagirajo s človeškim MATR3 in njegovo mutirano obliko MATR3S85C. V ta namen smo pripravili inducibilne ekspresijske celične linije HEK 293, ki stabilno izražajo fuzijski protein MATR3 oz. MATR3S85C z biotin ligazo BioID2, ali BioID2 brez fuzijskega partnerja. Ugotovili smo, da imata fuzijska proteina MATR3 in MATR3S85C z BioID2 enako celično lokalizacijo kot endogeni MATR3 in da je ligaza BioID2 v teh fuzijah encimsko aktivna. Po preučitvi aktivnosti BioID2 in celične lokalizacije izraženih proteinov smo nadaljevali s testom »pull down«, s katerim smo iz celičnih lizatov uspešno izolirali biotinilirane interakcijske partnerje obeh oblik MATR3. Z barvanjem s srebrom in imunodetekcijo biotiniliranih proteinov po prenosu western smo namreč zaznali proteine, ki so značilni za vzorce z MATR3 in MATR3S85C, ne pa tudi za vzorce z BioID2 brez fuzijskega partnerja. Te interakcijske partnerje bomo identificirali s tehniko tekočinske kromatografije, sklopljene z masno spektrometrijo. Rezultati bodo pripomogli k razumevanju interaktoma MATR3 in MATR3S85C. V eluatih z MATR3 in MATR3S85C smo sicer že zaznali dva znana interakcijska partnerja MATR3, proteina TDP-43 in NONO. Na koncu smo preverili še vpliv MATR3S85C na nastanek stresnih granul in na podlagi rezultatov zaključili, da ta oblika MATR3 prepreči njihovo tvorbo.20212021-12-01 14:40:01Magistrsko delo/naloga133573sl