Izboljševanje ločljivosti pri analizi Fc-fuzijskega proteina z metodo kapilarnega izoelektričnega fokusiranjaPlahutnik, Jakob (Avtor) Jamnik, Polona (Mentor) Kocjan, Boštjan (Komentor) analitske metodeseparacijske tehnikeizoelektrično fokusiranjefuzijski proteiniločljivostbiofarmacevtikiKapilarno izoelektrično fokusiranje je v zadnjem desetletju postala ena glavnih analitskih metod za določanje naboja in izoelektrične točke analita ter njegovih nabitih različic, še posebej za potrebe proizvodnje bioloških zdravil. Pri analizi fuzijskega proteina s to metodo lahko zaradi kompleksnih lastnosti molekul prihaja do nespecifičnih vrhov na elektroferogramih zaradi agregacije oz. precipitacije proteina. Da bi dosegli čim bolj natančno, zanesljivo in ponovljivo analizo proteina, je potrebno zagotoviti ustrezno topnost in stabilnost molekul v analitski kapilari. Pri izvedbi magistrskega dela smo pripravili nosilne mešanice z različnimi koncentracijami snovi za povečevanje topnosti (urea, formamid, saharoza, zwitterionski detergent CHAPS, zwitterionski NDSB v kombinaciji s taurinom), v katerih smo raztopili preučevano molekulo Fc-fuzijskega proteina. Pomagali smo si tudi z zmanjšanjem koncentracije proteina v nosilni mešanici, kar je izboljšalo ločljivost vrhov in ponovljivost elektroferogramov v primerih, ko je bilo ločevanje dokaj uspešno že pri višjih koncentracijah proteina (npr. pri dodatku formamida in saharoze). Nazadnje smo se poslužili encimske odstranitve negativno nabitih sialičnih kislin, ki zakrivajo proteinski del molekule. Pridobljeni elektroferogrami so bili za razliko od nativne različice pomaknjeni v bazičen del gradienta pH ter imeli manjše število vrhov. Najbolj uspešno ločbo smo dosegli z dodatkom 3 M uree pri koncentraciji proteina 0,4 mg/ml in času fokusiranja 12 minut; vse ostale koncentracije uree in drugih snovi za povečevanje topnosti ter krajši čas fokusiranja niso dosegli zadovoljivih rezultatov.[J. Plahutnik]20212021-11-07 07:15:06Magistrsko delo/naloga132946sl