​Protitumorski učinek avtologne tumorske vakcine v kombinaciji z obsevanjem na mišjih tumorskih modelihRemic, Tinkara (Avtor) Serša, Gregor (Mentor) Kamenšek, Urška (Komentor) avtologna tumorska vakcinaadjuvantni genski elektroprenosinterlevkin-12obsevanjezaviralci imunskih kontrolnih točkmelanomrak debelega črevesa in dankeZnanstveno izhodišče: Avtologne tumorske vakcine so tip terapevtskih vakcin, s katerimi želimo spodbuditi bolnikov imunski odziv za boj proti rakavemu obolenju. Sestavljene so iz gensko spremenjenih tumorskih celic, inaktiviranih z obsevanjem, ali iz tumorskega lizata. Nabor avtolognih tumorskih vakcin je majhen, med njimi pa še nobena ni bila odobrena za standardno zdravljenje. Namen doktorske raziskave je bil priprava in testiranje nove avtologne tumorske vakcine, pripravljene iz mrtvih tumorskih celic, z adjuvantnim genskim elektroprenosom plazmidne DNA z zapisom za interlevkin-12 (GEP IL-12) in vivo. Učinkovitost vakcine smo testirali v kombinaciji z lokalno radioterapijo, s katero smo želeli izpostaviti tumorske antigene, in zaviralci imunskih kontrolnih točk (ZIKT), protitelesi anti PD-1 in anti CTLA-4, s katerima smo želeli sprositi morebitno zavrtje imunskega sistema. Metode: Za raziskave smo uporabili mišje tumorske celice B16-F10 in CT26. Poskusi in vivo so potekali na miših C57Bl/6NCrl in Balb/cAnNCrl, ki so singenske izbranima tumorskima modeloma. Protitumorski učinek terapij smo spremljali z merjenjem velikosti tumorjev. Namen prvega dela raziskav je bil razvoj učinkovite tumorske vakcine B16-F10 in CT26. Pilotno vakcino smo pripravili z obsevanjem celic B16-F10 z dozo 25 Gy in jo testirali in vivo v kombinaciji z obsevanjem tumorjev. Pilotno vakcinacijo smo izvedli tako, da smo v podkožje miši, oddaljeno od tumorja, injicirali mrtve tumorske celice in izvedli GEP IL-12 okoli injiciranih mrtvih tumorskih celic (2,82 Hz, 170 V/cm, 150 ms). V nadaljevanju smo glede na rezultate histološke analize mesta pilotne vakcinacije izboljšali postopek priprave vakcine. Natančneje, izboljšano vakcino B16-F10 smo pripravili z obsevanjem 3 × 5 Gy in nato 30 Gy, izboljšano vakcino CT26 pa z obsevanjem 3 × 5 Gy in nato 2 × 30 Gy. Izboljšano vakcinacijo smo izvedli tako, da smo v podkožje miši, oddaljeno od tumorja, injicirali mešanico mrtvih tumorskih celic in plazmida IL-12 in izvedli GEP IL-12 v mešanici (5,64 Hz, 170 V/cm, 150 ms). Za določitev doprinosa vakcinacije k protitumorskemu učinku obsevanja (15 Gy) in vpliva vakcinacije na izrast tumorjev smo testirali dva odmerka vakcine (0,5 in 1 mg). Namen drugega dela raziskave je bila primerjava različnih obsevalnih in vakcinacijskih režimov. Najprej smo primerjali tri različne obsevalne režime: 1 × 5, 3 × 5 in 5 × 5 Gy v kombinaciji z vakcinacijo (1 mg) ob prvi frakciji obsevanja. Nato smo primerjali tri vakcinacijske režime: enkratno in večkratno vakcinacijo sočasno z obsevanjem ter večkratno vakcinacijo, ki smo jo začeli pred prvo dozo obsevanja. Namen tretjega dela raziskave je bilo ovrednotenje lokalnega in sistemskega imunskega odziva po kombinirani terapiji z izbranim obsevalnim in vakcinacijskim režimom pri obeh tumorskih modelih. Za imunohistokemijsko analizo smo odvzeli vzorce kože na mestu vakcinacije in tumorje, pri čemer smo označili imunske celice, pozitivne na grancim B, CD68 in FoxP3. Z analizo FluoroSpot smo analizirali prisotnost tumorsko specifičnih efektorskih imunskih celic, pozitivnih na grancim B in interferon ?, v bezgavkah. V četrtem delu raziskav smo ovrednotili doprinos ZIKT k vakcinaciji v kombinaciji z obsevanjem s protitumorsko učinkovitostjo ter histološko analizo tumorske nekroze in infiltracije imunskih celic v koži na mestu vakcinacije in v tumorjih. Rezultati: Po pilotni vakcinaciji smo na mestu vakcinacije opazili še žive tumorske celice ter večjo infiltracijo imunskih celic na mestu GEP kot na mestu injiciranih mrtvih tumorskih celic. Po izboljšanju postopka priprave vakcine na mestu izboljšane vakcinacije ni bilo več živih celic in opazili smo bolj enakomerno infiltracijo imunskih celic. Z enkratno izboljšano vakcinacijo smo doprinesli k protitumorskemu učinku obsevanja z dozo 15 Gy le pri tumorskem modelu B16-F10, ne pa tudi pri tumorskem modelu CT26. Po drugi stani pa smo z enkratno izboljšano vakcinacijo preprečili izrast do 56 % tumorjev CT26, ne pa tudi tumorjev B16-F10. Najučinkovitejši odmerek vakcine pri obeh tumorskih modelih je bil 1 mg. Najučinkovitejši obsevalni režim v kombinaciji z enkratno vakcinacijo pri obeh tumorskih modelih je bil 5 × 5 Gy. Najučinkovitejši vakcinacijski režim v kombinaciji s 5 × 5 Gy pri tumorskem modelu B16-F10 je bila enkratna vakcinacija, pri tumorskem modelu CT26 pa trikratna vakcinacija, izvedena sočasno z obsevanjem. Z vakcinacijo smo uspešno sprožili lokalni in sistemski imunski odziv, saj smo v kožo na mesto vakcine ter v tumor privabili makrofage, efektorske limfocite ter regulatorne limfocite. ZIKT niso doprinesli k protitumorskemu učinku vakcinacije v kombinaciji z obsevanjem ter niso povečali količine tumorske nekroze in infiltracije imunskih celic v tumor ali v kožo na mestu vakcinacije. Zaključki: Uspešno smo pripravili učinkovito avtologno tumorsko vakcino B16-F10 in CT26. S kombinirano terapijo z izbranimi obsevalnimi in vakcinacijskimi režimi smo pri obeh tumorskih modelih potrdili hipotezo, da vakcinacija doprinese k protitumorskemu učinku radioterapije. Prav tako smo pri obeh tumorskih modelih potrdili hipotezo, da z vakcinacijo izzovemo lokalni in sistemski imunski odziv. Zadnjo hipotezo smo ovrgli, saj smo dokazali, da ZIKT ne doprinesejo k protitumorskemu učinku vakcinacije v kombinaciji z obsevanjem. Rezultati doktorske raziskave bodo osnova za nadaljnji razvoj avtologne tumorske vakcine.20212021-10-20 07:15:09Doktorsko delo/naloga132275sl